分子生物学讲义 中山大学Word格式文档下载.docx

1、（5）基因转换（gene conversion）多见于真核生物当两相似的序列（等位基因、非等位基因均可）靠在一起时，就有可能发生基因转换，即一DNA序列转换成另一相似的序列基因转换的机制是基于重组，即先交换一段DNA序列，然后进行修复，就会使某一序列的比例增加3. 位点专一重组（1）噬菌体的整合与切除噬菌体整合到宿主基因组需整合酶（Int，的int基因编码）及宿主蛋白IHF，并通过同源区域attP（）与attB（宿主）的重组而达成噬菌体从宿主基因组切除需整合酶（Int）、Xis（的xis基因编码）及IHF，是整合的逆过程附着（整合）位点（att sites） attP与attB只在它们的中间区

2、域有一小段同源序列（15 bp，称为O）；attP的必需序列从152到+82（以O的中点为0），而attB只需25 bp左右的序列（包括中间的O）4. 转座（1）细菌转座子 插入序列（insertion sequences，IS）最简单的转座子，只含有转座所必需的元件：两端有反向重复序列（inverted repeats, 15 25 bp），中间有编码转座所需的酶的基因（至少有2个，编码转座酶，即transposase）插入序列在转座时，其插入位点两旁会产生一小段正向重复（direct repeats）带有抗生素抗性基因的转座子 除了必要的转座元件外，还含有抗生素抗性基因，能赋予其携带者某种

3、抗性 转座的机制复制性转座（replicative transposition） 转座过程有DNA复制，结果一个转座子留在原位，另一个插入到新的位点保守性转座（conservative transposition） 转座子离开原位置，插入到新的位点；这种转座又称非复制性转座（nonreplicative transposition ）（2）真核生物的转座子 玉米的Ds（dissociation）和Ac（activator） 最早发现（1940s）的转座子，与某些品种的玉米种子上的色斑变化有关（玉米种子的颜色由C基因编码的因子造成；若C基因突变，就没有色素产生，种子几乎白色；若部分细胞产生回复突

4、变，就会在种子上形成颜色斑点）Ac能自行转座，而Ds必须要有Ac的帮助才能转座Ac 或Ds插入到功能基因中，就会使该基因失活 Ds和Ac结构Ac与细菌的转座子相似，约4500 bp，两端有反向重复序列，中部含有转座酶基因Ds是Ac的衍生物（功能不全，不能自主转座），有Ds-a、Ds-b、Ds-c 3种 反转录转座子（retrotransposons） 以RNA作为中介进行复制（转座），与反转录病毒（retroviruses）的复制相似，含有编码反转录酶的基因，能进行反转录；酵母中的Ty（transposon yeast）、果蝇中的copia等反转录转座子的两端有LTRs（long termin

5、al repeats）原核生物的基因转录及表达调控1. 转录机器（装置）（transcription apparatus）（1）RNA聚合酶（RNA polymerase） （40 kD） （150 kD）， （160 kD） （70 kD）：specificity factor 核心酶（core enzyme）：， ，2 全酶（holoenzyme）： ， ，2 ，（2）启动子（promoter） 聚合酶的结合位点（binding site），一般位于转录起始位点上游 RNA聚合酶与启动子的结合 （RNA polymerase/promoter binding） Closed promote

6、r complex Open promoter complex，转录才能开始 Promoter structure 共同序列（consensus sequence）Pribnow box （-10 box, David Pribnow发现）-35 box（-10 box与-35 box的最佳距离为17 1 bp） 下调突变（down mutation） 上调突变（up mutation） Promoter structure 强启动子还有一些额外的元件，如E. coli编码rRNA的rrn gene中的UP element（上游元件），可提高表达数十倍（3）转录起始（transcription

7、 initiation）Four steps: Formation of a closed promoter complex Conversion of the closed promoter complex to an open promoter complex Polymerizing the first few nucleotides （up to 10） while the polymerase remain at the promoter Promoter clearance （4）延伸（elongation） 核心酶起极其重要的作用，亚基参与转录出的RNA的磷酸二酯键的形成 转录的

8、拓扑学：两种假说RNA polymerase 及新合成的RNA都围绕DNA旋转RNA polymerase前后的DNA反向旋转 第二种假说有较多的依据：拓扑异构酶（topoisomerase）的存在（5）转录终止（termination of transcription） 聚合酶到达终止子（terminator）就会从模板上脱落 终止子有两种（终止方式也有两种）intrinsic （-independent） terminator （termination）-dependent terminator （termination） -independent termination 较为简单，一段反

9、向重复序列（inverted repeat）与一富含T的区域（T-rich region in the nontemplate strand）即为终止信号终止子只有一段反向重复序列（能形成hairpin结构）是一种蛋白质（6聚体），可使RNA聚合酶的转录能力大大下降（具RNA-DNA解螺旋酶的作用，能解开转录复合体中RNA-DNA双链）2. 基因表达调控 原核生物基因表达的调控主要以操纵子（operon）的方式进行 Operon: A group of contiguous, coordinately controlled genes（1）乳糖操纵子（the lac operon） lacZ:

10、 -半乳糖苷酶（ - galactosidase）基因 lacY: 半乳糖苷透过酶（galactoside permease）基因 lacA: 半乳糖苷乙酰基转移酶（ galactoside transacetylase）基因 lacI: 调节基因（regulatory gene） Operator: 操纵区 Repressor: 阻遏子（阻遏物） Inducer: 诱导物（异构乳糖，allolactose）（2）操纵子的发现 发现过程-半乳糖苷酶可被诱导（Monod, 1940s）半乳糖苷透过酶与-半乳糖苷酶一起被诱导出来 （发现一种不能产生半乳糖苷透过酶的突变体）发现半乳糖苷乙酰基转移酶也

11、是同时被诱导出来发现一种组成型突变体（constitutive mutants）构建局部（部分）二倍体（merodiploid，带有野生型与组成型突变的等位基因），进行“ PaJaMo”系列实验（Arthur Pardee, Jacob, Monod），发现乳糖代谢基本调控规律 研究局部（部分）二倍体所得出的发现野生型（可被诱导型）等位基因是显性的，说明野生型等位基因能产生某种物质，使得与乳糖代谢有关的基因处于关闭状态，而在被诱导后才表达推测有一种可称为阻遏物（repressor）的物质存在；组成型突变体则是产生阻遏物的基因有缺陷既然有repressor，就应该有与repressor结合的DN

12、A序列（operator）；若operator有突变，不能与repressor结合，则是一种显性的组成型突变体 结论 通过阻遏基因（阻遏物）与操纵区，lacZ、lacY、lacA这3个结构基因是一起被调控的，它们组成了一个操纵子（the lac operon）后来的研究证实了Jacob与Monod的预言，并使操纵子的慨念进一步完善（3）阻遏的机制 两种假说 聚合酶与阻遏物可一起结合在lac operon的启动子区，阻遏物的作用只是阻止转录从起始状态进入延伸状态 阻遏物的作用是不让RNA聚合酶进入lac operon的启动子（得到最新实验数据的支持）（4）乳糖操纵子的正调控 阻遏物的调控是负调控

13、，乳糖操纵子的调控还需正调控因子 代谢物阻遏效应（catabolite repression） cAMP在细胞中的浓度与葡萄糖的含量成反比，它与一种称为代谢物激活蛋白（catabolite activator protein，又称CAP，另一称呼是环腺苷酸受体蛋白：cAMP receptor protein，CRP）一起，起到正调控作用。因此，起正调控作用的是CAP-cAMP 乳糖操纵子的启动子实际上是一种弱启动子，其 -35 box与原核启动子相应的共同序列相差甚大，因此才需要CAP-cAMP进行正调控；如果是强启动子（与共同序列十分相近），则不需要正调控，但这种情况会使得即使葡萄糖存在，乳

14、糖操纵子也一样运作。（5）CAP的作用机制 通过对有关突变体进行分析，发现CAP-cAMP的结合位点在启动子的上游（与启动子紧密相邻），该位点称为激活物位点（activator site）。 CAP-cAMP结合到激活物位点后，就会促进RNA聚合酶与DNA形成open promoter complex（ CAP-cAMP 能加快closed promoter complex的形成，从而提供了更多形成open promoter complex 的机会），结果是促进转录。6）阿拉伯糖操纵子（the ara operon） 像乳糖操纵子那样，也是一种有代谢物阻遏效应的操纵子 the ara oper

15、on 又称the araCBAD operon，即有控制基因C和结构基因B、A、D（编码阿拉伯糖代谢所需的酶） 独特之处两个ara 操纵区： araO1和araO2，前者调控控制基因araC 的转录，后者控制启动子PBAD（在PBAD上游265与294 bp之间）CAP（catabolite activator protein）结合位点在ara 启动子（PBAD）的上游约200 bp处 araC 的自我调节（autoregulation） araO1起作用：当AraC（araC 的产物）含量升高，便与araO1结合，阻止进一步转录araC ，以免产生过多的AraC（7）色氨酸操纵子（the t

16、rp operon） 合成代谢的操纵子，所编码的酶能把色氨酸前体分枝酸（chorismic acid）转化为色氨酸。色氨酸浓度高，则关闭；色氨酸浓度低，则开启 具弱化子（attenuator），无CAP-cAMP调控 色氨酸操纵子有5个结构基因（EDCBA）及1个调节基因（R） 启动子（trpP）与操纵区（trpO）在结构基因的上游，且操纵区完全在启动子里面 在调控中，色氨酸的作用是帮助阻遏物结合到操纵区，从而使操纵子关闭 弱化作用（attenuation） 在阻遏作用的基础上（色氨酸操纵子的阻遏作用较弱），能再降低转录水平10 倍前导区与弱化子转录物的第一种较稳定的结构有一终止子（-inde

17、pendent terminator），能使弱化作用发生，转录终止转录物的第二种较不稳定的结构没有终止子，转录能继续色氨酸的多寡决定形成哪一种结构（在转录与翻译偶联的情况下） 在细菌中，当色氨酸操纵子的前导区转录后，翻译就开始 核糖体到达色氨酸密码子色氨酸缺乏，核糖体不能前进，翻译受阻，前导区与弱化子转录物只能形成第二种结构；结构基因能转录色氨酸充足，前导肽的翻译能顺利完成，前导区与弱化子转录物能形成第一种较稳定的结构，导致弱化作用发生 调控能达成的必要条件转录与翻译偶联，且速率大致相等每个结构基因的转录产物都有其起始密码子，核糖体从各个基因的mRNA的起始信号（密码子）开始翻译，即结构基因的

18、翻译与前导序列的翻译无关 细菌能符合这样的要求，说明其体系中各组分的协调性3. 基因表达调控的重大变化（1）宿主RNA聚合酶的变化 主要由因子的改变引起 枯草杆菌（Bacillus subtilis）被其噬菌体SPO1入侵后的情况SPO1早期基因（early genes）的表达用宿主本身的RNA聚合酶，仍可有很多宿主基因表达SPO1中期基因（middle genes）的表达宿主中基本上只有噬菌体的基因在表达SPO1后期基因（late genes）的表达（2）T7噬菌体编码的RNA聚合酶 T7基因的转录分3个阶段（在宿主E. coli中）Class I（共5个基因，其中一个编码一种噬菌体专一的R

19、NA聚合酶）Class IIClass III 先由宿主的RNA聚合酶，然后由T7自己的RNA聚合酶来达成3个阶段的转录（3）芽孢形成过程的转录控制（枯草杆菌） 通过变换RNA聚合酶的因子而达成每种因子所识别的启动子都各不相同 从营养（植物性）生长到产生内生孢子（芽孢）需关闭很多营养生长期的基因，并开启专门用于芽孢形成的基因 营养生长期RNA聚合酶的因子43（A） 芽孢形成时RNA聚合酶的因子至少有29 （E）、30 （H）、32 （C）4）具多启动子的基因 枯草杆菌的spoVG基因芽孢形成所需的基因之一该基因有分别被B和E识别的启动子两个启动子互相重叠可被含B或E的RNA聚合酶转录 鱼腥蓝细

20、菌属（Anabaena）谷酰胺（glutamine）合成酶基因（glnA）NH4+充足时，细胞处于营养生长状态NH4+缺乏时，会产生一些能固氮的异形胞 （heterocyte）；在异形胞中，大部分营养生长的基因都关闭了，而固氮基因（nif）则开启glnA基因在营养生长时及固氮的异形胞中都必不可少glnA基因有两个启动子，可被不同的识别 E. coli的谷酰胺合成酶基因（glnA）NH4+充足时，RNA聚合酶用70 ，识别弱启动子P1NH4+缺乏时， RNA聚合酶用54 ，识别强启动子P2，以合成出更多的谷酰胺（起到贮存NH4+的作用）双启动子的意义 使基因在不同情况下都可表达，或不同情况下有不

21、同的表达强度5）E. coli的热激基因（heat shock genes） 热激反应（heat shock response）细胞处于较高的温度中所引发的反应正常的转录减少或停止，热激反应的转录物开始产生，以降低细胞的损伤程度 分子伴侣（molecular chaperon）协助蛋白质正确折叠的一类物质（一般也是蛋白质），在热激反应中也会产生在热激状态下，分子伴侣的作用是帮助已部分变性（折叠已发生变化）的蛋白质重新正确折叠好 在热激状态下，细胞还会产生蛋白酶，以降解不能重新折叠好的蛋白质 热激反应所需的基因表达重大改变也是通过更换RNA聚合酶的因子而达成32（H）代替70（A）H并非在热激后

22、才产生，细胞原来已有少量的H存在，但处于一种不起作用的状态（被隔离）受热激后，这些H能马上起作用，导致更多的H以及分子伴侣和蛋白酶的产生（6）噬菌体对E. coli的侵染 溶菌模式（lytic mode）噬菌体DNA进入宿主细胞后，利用宿主的RNA聚合酶进行转录，进一步翻译产生噬菌体蛋白质噬菌体DNA进行复制，从而组装出许多子一代的噬菌体宿主细胞裂解，释放出这些子代的噬菌体 溶原模式（lysogenic mode）噬菌体DNA进入宿主细胞后，进行一些早期基因的转录和翻译产生一种27 kD的蛋白质（阻遏物， repressor），该阻遏物通过与2个操纵区结合，使得本身的大部分基因关闭，只剩下阻遏

23、物的基因在表达 噬菌体DNA整合到宿主基因组中，与宿主DNA一起复溶原菌（lysogen）携带有整合在基因组中的噬菌体DNA的细菌 原噬菌体（prophage）整合在宿主基因组中的噬菌体DNA 噬菌体的基因组线状：在噬菌体粒子中的存在状况，两端有粘性末端（cos）环状：噬菌体DNA刚进入宿主后的存在状况 溶菌模式的基因表达调控 三个转录阶段前早期（immediate early）晚早期（delayed early）晚期（late） 三个时期的基因在基因组中顺序排列 用到抗转录终止（antitermination）机制 抗转录终止（antitermination）的机制抗终止蛋白与mRNA或DN

24、A上的特异位点结合，再改变RNA聚合酶，使其忽略有关的终止子与mRNA结合：抗终止蛋白N与DNA结合：抗终止蛋白Q 溶原模式的建立晚早期部分基因的产物是进入溶原模式所需的整合噬菌体DNA到宿主基因组所需的蛋白质引起cI基因转录，产生阻遏物（ cII 和 cIII 产物的作用） cII 和 cIII 产物的作用cII的产物能帮助RNA聚合酶结合到PRE ，从而可开始转录cro的反义RNA及cI 的mRNA；前者能抑制cro mRNA的作用，后者可翻译出阻遏物cIII的产物能延迟细胞内的蛋白酶分解cII的产物 溶原模式的维持与cI基因的自我调节阻遏物（cI 的产物）产生后，通过与操纵区OR和OL结

25、合，可阻止更多的早期基因转录，又能促使RNA聚合酶以PRM为启动子转录cI 基因cI 基因的产物（阻遏物）的浓度能调节cI基因本身的转录（自我调节） 溶菌模式还是溶原模式？由cI与cro基因产物的竞争结果决定cI取胜，进入溶原模式cro取胜，进入溶菌模式 CII（cII 基因的产物）的浓度决定cI与cro谁胜谁负， CII 越多，越容易进入溶原模式 CII的浓度又取决于细胞内蛋白酶的浓度生长环境好（养分丰富），细胞内蛋白酶浓度高处于饥饿状态，细胞内蛋白酶浓度低细胞处于饥饿状态，有利于溶原模式的建立生长环境好，有利于溶菌模式的建立溶菌模式与溶原模式在不同条件下建立的生物学意义 溶原菌进入溶菌模式

26、的诱导溶原菌受到化学诱变剂或辐射作用后，其原噬菌体就会进入溶菌途径诱变导致DNA损伤，引发SOS应答（SOS response），其中recA基因起最重要的作用（RecA用于DNA损伤的重组修复）诱变的环境还会使RecA成为一种辅蛋白酶（coprotease），激活阻遏物本身的蛋白酶活性，使其自我切割，从操纵区脱落，从而引发溶菌模式四、真核生物的基因转录及其调控1. 真核生物的RNA聚合酶 RNA聚合酶I（polymerase I） 位于核仁 RNA聚合酶II （polymerase II） 位于核质 RNA聚合酶III （polymerase III）1）三种RNA聚合酶对转录抑制剂的反应

27、-鹅膏蕈碱（ -amanitin） 抑制polymerase II（低浓度） 抑制polymerase II 和polymerase III（高浓度） 放线菌素D（actinomycin D） 抑制polymerase I（2）真核RNA聚合酶的亚基组成 Polymerase I、II、III都由多个亚基组成 均有两个较大的亚基（ 100 kD） 另有多个较小的亚基（大部分 50 kD） 三种聚合酶都有一些共有亚基（common subunit） 以酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae） 的Pol II为参照：Rpb5、Rpb6、Rpb8、Rpb10、Rpb12（3）RNA聚合酶II的结构 研究得比较清楚的一种