LCAPCIMSMS法同时测定尿液中的三聚氰胺和三聚氰精Word文件下载.docx

1、中图分类号 O 657 文献标识码 A 文章编号 1004-8685（2010 11-2701-04Simultaneous determ ination ofm ela m ine and cyanuric acid in the urine by LC -APCI -M S /MSJ I AN Long -hai 1, WEN H ong -liang 1, KUANG X i n -yu 2, X U H ong 2, WANG K e 1, J I Shen 1（1. Shangha i Instit ute for Food and D rug Contro, l Shangha i

2、 201203, Chi na ; 2. Ch il dren sH osp ital of Fudan U niversity , Shang ha i 201102, Ch i naAb stract O bjective :To establis h a li qu i d chro m a t og raphy -at m ospher ic pressure che m i ca l ion ization tande m m ass spectro m etr ic m ethod （LC -A PC I-M S /MS f o r the de ter m i nati on o

3、f m e l am i ne and cyanuric ac i d i n ur i ne sa m ples . M ethod s :U rinesa m ples w ere m i xed w i th iso top ic l abeled i nterna l standards, 15N 3 -m e l am ine and 13C-cyanur i c ac i d , and dil uted w ith acetonitr ile . A fter centr if ugation and separa ted on aW ate rs XB ri dge T M A

4、m i de co l u m n , the ana lytes we re detec ted by A PC I-M S /M S w it h the m ultiple reac ti onm onito ri ng （MRM m ode , po siti ve for m e l am i ne and nega tive for cyanur i c acid . R esu lts :Ca li b ration curves w ere li near i n the range of 20ng /ml 1000ng /ml fo rm e la m i ne and cy

5、anur i c ac i d , bo th w ith the correlati on coe fficien t better than 0. 995. The i ntra and i nter-ba tch prec i sion （RS D both less than 10%, and the accurac i es and recover i es w ere bo t h i n the rang e o f 89. 9%111. 2%.Conc l usion :T he m ethod is si m ple , sensiti ve and spec ifi c f

6、or the quantitati ve de ter m i nati on o fm ela m i ne and cyanur i c ac i d i n the uri ne .K ey words M ela m i ne ; Cy anur ic aci d ; A PCI , LC -M S /MS ; U ri ne2008年 , 我国发生婴 幼儿因 服用 受三 聚氰胺 污染 的奶粉 而导致尿路疾病的 事件。之 后 , 美 国 FDA 在奶粉 中检 出三聚 氰酸。动物实验表 明 , 三聚 氰胺 和三 聚氰 酸同 时存 在会 导致 肾中毒 1, 且主要经尿 以原型 排出 体外

7、2, 3, 因此 有必 要对尿 液中三聚氰胺和三聚 氰酸的浓度进行监控。三聚氰 胺 和 三 聚 氰 酸 尿 液 浓 度 测 定 方 法 有 LC -M S 法 4、 LC-M S /M S 法 58, 其前处理方法为固相萃取 46或液 -液萃取 7, 8, 且均未对 三聚 氰胺 和三聚 氰酸 进行同 时测 定 , 故分析时间较长。本研究以同位素 标记的化 合物为 内标 , 首次建 立了以 LC -A PC I-M S /M S 法同时测定 尿液中 的三聚 氰胺和 三聚 氰酸。 样品前处理简单 , 灵 敏度 高 , 分析 时间 短 , 可满 足临 床的 快速 诊疗需要。1 材料与方 法1. 1

8、仪器与试剂AP I 4000串联 四极杆质 谱仪 （美 国应 用生物 系统 公司 。 ACQU ITY U ltra Pe rf o r m ance LC 液 相 色 谱 仪 （美 国 W ate rs 公 司 。 M I KRO 200R 离心机 （德国 H ettich 公司 。超纯水器 （美 国 M illi po re 公司 。三聚氰 胺标准品 （德 国 D r . Ehrenstorfer 公 司 , 批号 80916 。三聚氰酸标准 品 （美国 A LDR IC H 公司 , 批 号 1199458 。三聚氰胺 -15N（加拿大 T oron t o R esearch Che

9、mica l 公司 , 批 号 :5-GBH -49-1 , 三 聚 氰 酸 -13C（德 国 W ITEGA L aborator i en Berli n -A dlersho f 公司 , 批 号 :090204 。 乙腈 （色谱纯 , 美国 M e rck 公司 。1. 2 色谱条件色谱柱 :i e TM de （. m, . mm 2701中国卫生检验杂志 2010年 11月 第 20卷 第 11期 Ch i n ese Jou r n al ofH ealth Laborat ory Tec hno l ogy , Nov 2010; Vo l20 N o 11（美国 W ater

10、s 公司 。 流动 相 :乙腈 -10mm ol/L甲 酸铵 水溶 液 （80 20, 等 度洗脱。流速 :0. 8m l/mi n 。进样体积 :10 l 。 1. 3 质谱条件A PC I 源 , M RM 扫描方式 , 正、 负离 子切 换模式 :07m i n （负离子 , 7m i n13m i n（正离子 。碰撞气 （CAD :5; 气帘气 （CUR :22ps; i 雾化气 （G S1 :73ps; i 去溶剂气体温度 （TE M :350 ; 电喷雾电压 （IS:-4500V （负离 子 , 5500V （正离子 ; 雾化电流 （NC :1 A （正 离子 , -2 A （负离

11、子 ; 去簇 电压 （DP :71V （正离 子 , -45V （负 离 子 。 三聚 氰胺 :m /z 127 85（用 于 定 量 , CE :27e V , m /z 127 68（用 于 定 性 , CE :39eV ; 内标 （三聚 氰胺 -15N 3:m /z130 87（CE :27e V 。三聚氰酸 :m /z128 42（用 于定量 , CE :28eV , m /z 128 85（用 于定性 , CE :14eV ; 内标 （三聚氰酸 -13C 3 :m /z 131 43（CE :28eV 。 1. 4 尿样采集采集临 床尿样约 10m , l 置 -78 保存。样品测定

12、时 , 取冻 存样品室温下解冻 , 备用。 1. 5 标准储备溶液的制备标准储备 溶 液 :精 密称 取 三聚 氰 胺、 三 聚氰 酸 标 准 品适 量 , 分别用乙腈 -水 （1 1 制成 0. 10m g /ml 的标 准储备 溶液。 再分别用水稀释成 0. 50 g /ml 、 2. 50 g /ml 、 10. 0 g /ml 的标 准应用液 , 用于配制标准曲线和质控样品。内标溶液 :分别精密称取三聚氰胺 -15N 3、 三聚氰酸 -13C 3标准品适量 , 用乙腈 -水 （1 1 制成 0. 10m g /ml 的储备 溶液 ,再用水分别稀释至 10 g /ml 、 25 g /m

13、l 。 1. 6 样品处理取 尿液 0. 50m l 于 1. 5m l 离心管中 , 加入三聚氰胺内标溶 液 （10 g /m l 和三聚氰酸内标 溶液 （25 g /ml 各 20 , l 涡旋 振荡 30s , 加 乙 腈 0. 5m , l 涡 旋 振 荡 30s , 密 塞 , 高 速 离 心 （14000r /min 2m in , 取上清液供 LC -A PCI-M S /MS 分析。 1. 7 空白样品 、 标准曲线和质控样品的制备空白 尿液 :取 6个不 同个 体来源 的空 白尿液 , 混 匀 , 作为 标准曲线和质控用空 白尿液。空白样品 :取 空白尿 液 0. 50m l

14、 于 1. 5m l 离心 管中 , 加乙 腈 0. 50m , l 涡 旋 振 荡 30s , 密 塞 , 高 速 离 心 （14000r /mi n 2m i n , 取上清 液供 LC-A PC I-M S /M S 分析。标准曲线 :取空白尿液 0. 50m l 于 6个 1. 5m l 离心 管中 , 分 别 加 入 三 聚 氰 胺、 三 聚 氰 酸 标 准 溶 液 （0. 50 g /ml 、 2. 50 g /ml 、 10. 0 g /ml 适量 , 涡旋振荡 30s , 静置 10m i n , 使 添 加 浓 度 为 20ng /ml 、 50ng /ml 、 100ng

15、/ml 、 200ng /ml 、 500ng /ml 、 1000ng /m, l 余 同样品处理方法处理后进样分析。质控样品 :同 标 准 曲 线的 制 备 方 法 制 备 3个 添 加 浓 度 （20ng /ml 、 100ng /ml 、 900ng /ml 的 质控样 品 , 余同 样品 处理 方法处理后进样分析 。 2 实验结果 2. 1 专属性在所采用条件 下 , 三聚 氰胺 和三 聚氰 酸的 保留 时间 分别 为 5. 6m i n 和 8. 9m i n , 空白样 品不干 扰三 聚氰胺 和三 聚氰酸 , （。1. 三聚氰胺 ; 2. 三聚氰胺内标 ; 3. 三聚氰酸 ; 4

16、. 三聚氰酸内标 A:空白尿液添加三聚氰胺 （含三聚氰胺 50ng /ml, B:三聚氰胺 尿 液样品 （含三聚氰胺 98ng /m l, C:三聚氰 胺空白尿 液 , D:空白 尿 液添加三聚氰 酸 （含三 聚氰 酸 50ng /m l, E:三聚 氰酸 尿液 样 品 （含三聚氰酸 23ng /ml, F :三聚氰酸空白尿液图 1 三聚氰胺和三聚氰酸的色谱图2. 2 标准曲线和定量下限 （LLOQ 以浓度为横坐标 , 待测物与内标 的峰面 积比为 纵坐标 , 以1/X2 为权重系 数进行线性回归 , 得回归方程 :三聚氰胺 Y =0. 00295X -0. 00906, r =0. 9991

17、; 三 聚 氰 酸 Y =0. 000536+0. 0151, r =0. 9989。 结 果 表 明 , 三 聚 氰 胺 和 三 聚 氰 酸 均 在 20ng /ml1000ng /ml 范 围内线 性关 系良好。 LLOQ 为 10倍 信噪比时样品中待 测组 分的 浓度 , 结 果三 聚氰 胺和 三聚 氰酸 的 LLOQ 均为 20ng /ml 。2702中国卫生检验杂志 2010年 11月 第 20卷 第 11期 Ch i nes e J ournal ofH ealt h Lab oratory T echnol ogy , N ov 2010; Vol 20 No 112. 3 精密

18、度和准确度试验取低、 中、 高质控样 品 , 分别在 同一 天内 （n =6 和 不同天 内 （n =3 按上述 样品处 理方 法处理 后进 样分析。 计算 批内、 批间精密度和准确度 , 结果见表 1。表 1 尿液中三聚氰胺和三聚氰酸测定的精密度和准确度试验理论浓 度 （ng/ml 方法回收率 （%（ s 提取 回收率 （%批内 RSD （%（n =6批间 RS D （% （n =18三聚氰胺 20102. 7 8. 5101. 7 8. 88. 99. 210096. 4 5. 997. 5 5. 86. 06. 4900102. 3 4. 298. 1 4. 34. 34. 7三聚氰酸

19、2098. 6 8. 498. 4 8. 58. 68. 910098. 5 5. 599. 2 5. 65. 65. 9900100. 2 3. 5100. 2 3. 63. 53. 72. 4 提取回收率试验样品 :取低、 中、 高浓度 质控样 品各 6份 , 各 取 0. 50m l 于 1. 5m l 离 心 管 中 , 加 乙 腈 0. 5m , l 涡 旋 振 荡 30s , 高 速 离 心 （14000r/mi n 2m i n , 取上清液 0. 8m , l 加入三聚氰胺内标溶液 （10 g /ml 和三聚氰酸内标溶 液 （25 g /ml 各 20 , l 涡旋振 荡 30

20、s , 进 样 分 析。计 算待 测 物与 其 内 标的 峰 面积 比 , 计为 Rs。对照 :以水代 替空 白尿 液同 法处 理。计算 待测 物与 其内标的峰面积比 , 计为 Rc计算 R s /R的 比 值 , 求 得 回 收 率。 结 果 回 收 率 均 在89. 9%110. 5%之间 , 平均值及其 偏差见表 1。2. 5 稳定性试验2. 5. 1 供试品溶液的稳定 性 取低、 中、 高浓度 质控样 品 , 按 样品处理方 法操 作 , 取 待测 上清 液放 置 0、 1h 、 2h 、 4h 、 8h 、12h 后进样分析 , 结果表明供试品溶液可稳定 12h（见表 2 。2. 5

21、. 2 样品室温放置的 稳定性 取低、 中、 高浓 度质控 样品 , 室温放置 0、 3h 、 6h 、 9h 、 12h 后按样品处理 方法操作 , 结果表 明样品室温下可稳定 12h（见表 2 。表 2 尿液中三聚氰胺和三聚氰酸稳定性试验结果（以理论浓度的百分比表示 理论浓 度 （ng/ml 供试品溶液室温下稳定性 （% （x s 尿液样品室温下冻 融样品的稳 定 性 （% （x s 三聚氰胺 20100. 1 8. 498. 5 8. 7101. 4 8. 6 10098. 9 6. 299. 6 5. 799. 5 6. 4 900100. 2 4. 398. 1 4. 098. 6

22、4. 4三聚氰酸 2098. 3 8. 6102. 1 8. 6101. 4 8. 7 10099. 8 5. 397. 5 4. 799. 2 5. 0 90097. 9 3. 9100. 1 4. 0100. 8 4. 02. 5. 3 冻融稳定 性试 验 取 低、 中、 高浓 度质 控样 品进 行冻 融试验 （反复冻融 1、 2、 3次 , 并 与未 冻融 的质控 样品 进行比 较 , 结果表明冻融稳定性良好 （见表 2 。2. 6 样品测定, 对 批 可 幼 儿 样 品 定 , 结 果 有 51批 样 品 检 出 三 聚 氰 胺 , 含 量 在 22ng /ml 978ng /ml 之

23、 间 ; 有 21批 样品 检出 三聚 氰酸 , 含 量在 23ng /ml 199ng /ml 之间 ; 有 16批 样品 同时 检出 三聚 氰 胺和 三 聚氰 酸 , 两者含量之间无明显相关性。3 讨论3. 1 质谱条件的优化3. 1. 1 离 子化源的选 择 LC-M S /M S 法常 用的离子 化源有 电喷雾离子化源 （ESI 源 和 APCI 源。 若采用 ESI 源 , 可 能产 生基质抑制 效应、 继 而产 生灵 敏度 差的 问题 9; 若 采用 APC I 源 , 基质抑制 效应可明显改善 10, 且 可直接用于尿液样品的分 析 11。本文曾采用 ESI 源进行测定 , 结果

24、三聚 氰酸响应差 ; 改 用 A PC I 源测定 , 三聚氰酸灵敏度明显 增强 , 故 选择 A PC I 源进 行测定。3. 1. 2 其它质谱条 件的优化 利 用注射泵以 30 l/mi n 流速 分别将 10. 0 g /ml 的三聚氰胺和三 聚氰酸标准溶液及其相应 内标溶液通过三通管汇合流速为 0. 8m l/mi n 的流动相 注入到 离子源中 , 分别在正负离子模式下 扫描 , 结果得 到各待 测组分 的准分子离子峰。然后对各准分子离子 峰分别进 行 DP 扫 描 , 选择响应最高的 DP 值后再进行子离子扫描 , 得到碎片 离子信 息。在 M RM 模式下 , 对各个子离子的

25、CE 值进行扫描 , 选取响 应最高的 CE 值后 再分别对 CAD 、 C UR 、 G S1、 TE M 、 IS 、 NC 等参 数进行优化 , 使 三 聚氰 胺 和三 聚 氰酸 的 响应 达 到 最佳 状 态。 NC 值的变化可同时显著影响待测 组分和噪 音的响 应大小 , 故 NC 值的优化需以信噪比作为考察指标。对三聚氰胺和三 聚氰 酸分 别选 择两 对 监测 离子 对 , 选取 干扰小、 信噪比大的离子对作为定量离子对。3. 2 色谱条件的优化3. 2. 1 色谱柱的 选择 分 别采用 W aters A tlantis H I L IC 色谱 柱 （3 m, 2. 1 150m

26、m 和 W aters XB ri dge TM Am i de 色谱柱 （3. 5 m, 4. 6 250mm 进行分析 , 结果 在 H IL IC 色 谱柱上 , 三聚 氰酸保留时间短 , 响 应差 ; 改 用 Am i de 色 谱 柱后 , 三 聚氰 酸保 留时间增加 , 响应较好。故选用 Am i de 色谱柱作进一步分析。 3. 2. 2 流 动 相的 优 化 以 W a ters XB ri dge TM Am ide 色 谱 柱 （3. 5 m, 4. 6 250mm 为分 析柱 , 分 别采用 流动 相 乙腈 -10mmo l/L甲 酸 铵 水 溶 液 （80 20 、 流

27、 动 相 乙 腈 -0. 1%甲酸水溶液 （80 20 进行 测定 , 结果 在流 动相 下 , 三 聚氰酸保留时间为 5. 9m i n , 三聚氰胺在 15m i n 内 未出峰。在 流动相 下 , 保留时间如图 1所示。根据上述 结果 , 对甲 酸 铵的 浓 度 进行 优 化 , 结 果 浓度 在 5mm o l/L20mmo l/L时 , 三聚氰胺和三聚 氰酸的保留 时间和 响应均无明显变化。流动相中乙腈的比例对 保留时间 有较大 影响。分 别采用 不同比例的乙腈 （70%、 80%、 90% 进 行考察 , 结 果含 90%乙 腈时 , 三聚氰胺保留时间 偏长 ; 含 70%乙 腈时

28、 , 三聚 氰胺 与三 聚氰酸色谱峰之间的分离度较 差 , 不利于正 负离子 切换扫 描 ; 含 80%乙 腈时 , 保留 时间适 中 , 分 离度好 , 无 干扰。故最 终选 择流动相 作为流动相。3. 3 样品前处理方法的优化为了改善峰形 , 在样品中加入一倍量的乙腈进行稀释。 为了 尽可能 地减少 基质效 应的 影响 , 对 三聚氰 胺和 三聚 （下转第 页 2703后做进一步的观察和研究。 因此 , 泌尿科 医生在 患者发 热后 , 应先考虑送血培养 , 而不是先使用 抗生素 , 这 在一定程 度上可 避免因抗生素的滥用 而引起的血流感染的发生。此外 , 患者老龄化 （平均年龄 65岁

29、 及 均患有不同程度的 高血压、 心脏病、 糖 尿病 等基 础病 , 也 是更 易发 生血 流感 染的 原因之一。血培养阳性菌 群分 布以 革兰 阴性 菌为 主 , 大肠 埃希 菌占 47. 2%, 这是因为 泌尿 外科 患者 术前 常伴 有革 兰阴 性菌 引起 的泌尿系感染 , 同时由于患者自身、 手 术等原 因使定植 于泌尿 系的致病菌 可 通过 局 部病 灶 进入 血 液 , 从 而导 致 血 流感 染。 36例培养阳性病例中 未检出 鲍曼 不动 杆菌 , 这说 明鲍 曼不动 杆菌不是引起泌尿外 科住院患者血流感染的主要致病菌。 总之 , 控制医院内血流感染是 一个复 杂工程 , 需要 采取多 方位、 多角度的手段 , 严 格的 消毒 隔离、 规 范化 的操 作和 患者 个人状态的调整等都 将对降低泌尿科 住院患 者血流感 染的发 生起到积极作用 ; 积 极治 疗原 发疾 病 , 去除 可能 的诱 发因 素 , 注意无菌操作 , 合理使用抗菌药物 是减少 血流感 染发生 率、 提 高治愈率的关键。参考文献 1Bourn eton O , M u telT , H eranney D, et al . In ci dence of