LCAPCIMSMS法同时测定尿液中的三聚氰胺和三聚氰精Word文件下载.docx
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[中图分类号]O657[文献标识码]A[文章编号]1004-8685（201011-2701-04
SimultaneousdeterminationofmelamineandcyanuricacidintheurinebyLC-APCI-MS/MS
JIANLong-hai1,WENHong-liang1,KUANGXin-yu2,XUHong2,WANGKe1,JIShen1
（1.ShanghaiInstituteforFoodandDrugContro,lShanghai201203,China;
2.ChildrensHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China
[Abstract]Objective:
Toestablishaliquidchromatography-atmosphericpressurechemicalionizationtandemmassspectrometricmethod（LC-APCI-MS/MSforthedeterminationofmelamineandcyanuricacidinurinesamples.Methods:
Urine
samplesweremixedwithisotopiclabeledinternalstandards,15N3-melamineand13C
-cyanuricacid,anddilutedwithacetoni
trile.AftercentrifugationandseparatedonaWatersXBridgeTMAmidecolumn,theanalytesweredetectedbyAPCI-MS/MSwiththemultiplereactionmonitoring（MRMmode,positiveformelamineandnegativeforcyanuricacid.Results:
Calibrationcurveswerelinearintherangeof20ng/ml~1000ng/mlformelamineandcyanuricacid,bothwiththecorrelationcoefficientbetterthan0.995.Theintraandinter-batchprecision（RSDbothlessthan10%,andtheaccuraciesandrecoverieswerebothintherangeof89.9%~111.2%.Conclusion:
Themethodissimple,sensitiveandspecificforthequantitativedeterminationofmelamineandcyanuricacidintheurine.
[Keywords]Melamine;
Cyanuricacid;
APCI,LC-MS/MS;
Urine
2008年,我国发生婴幼儿因服用受三聚氰胺污染的奶粉而导致尿路疾病的事件。
之后,美国FDA在奶粉中检出三聚氰酸。
动物实验表明,三聚氰胺和三聚氰酸同时存在会导致肾中毒[1],且主要经尿以原型排出体外[2,3],因此有必要对尿液中三聚氰胺和三聚氰酸的浓度进行监控。
三聚氰胺和三聚氰酸尿液浓度测定方法有LC-MS法[4]、LC-MS/MS法[5~8],其前处理方法为固相萃取[4~6]或液-液萃取[7,8],且均未对三聚氰胺和三聚氰酸进行同时测定,故分析时间较长。
本研究以同位素标记的化合物为内标,首次建立了以LC-APCI-MS/MS法同时测定尿液中的三聚氰胺和三聚氰酸。
样品前处理简单,灵敏度高,分析时间短,可满足临床的快速诊疗需要。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
API4000串联四极杆质谱仪（美国应用生物系统公司。
ACQUITYUltraPerformanceLC液相色谱仪（美国Waters公司。
MIKRO200R离心机（德国Hettich公司。
超纯水器（美国Millipore公司。
三聚氰胺标准品（德国Dr.Ehrenstorfer公司,批号80916。
三聚氰酸标准品（美国ALDRICH公司,批号1199458。
三聚氰胺-15N
（加拿大TorontoResearchChem
ical公司,批号:
5-GBH-49-1,三聚氰酸-13C
（德国WITEGALaboratorienBerlin-Adlershof公司,批号:
090204。
乙腈（色谱纯,美国Merck公司。
1.2色谱条件
色谱柱:
ieTMde（.m,.mm2701
中国卫生检验杂志2010年11月第20卷第11期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2010;
Vol20No11
（美国Waters公司。
流动相:
乙腈-10mmol/L甲酸铵水溶液（8020,等度洗脱。
流速:
0.8ml/min。
进样体积:
10l。
1.3质谱条件
APCI源,MRM扫描方式,正、负离子切换模式:
0~7min（负离子,7min~13min（正离子。
碰撞气（CAD:
5;
气帘气（CUR:
22ps;
i雾化气（GS1:
73ps;
i去溶剂气体温度（TEM:
350;
电喷雾电压（IS:
-4500V（负离子,5500V（正离子;
雾化电流（NC:
1A（正离子,-2A（负离子;
去簇电压（DP:
71V（正离子,-45V（负离子。
三聚氰胺:
m/z12785（用于定量,CE:
27eV,m/z12768（用于定性,CE:
39eV;
内标（三聚氰胺-15
N3:
m/z13087（CE:
27eV。
三
聚氰酸:
m/z12842（用于定量,CE:
28eV,m/z12885（用于定性,CE:
14eV;
内标（三聚氰酸-13
C3:
m/z13143（CE:
28eV。
1.4尿样采集
采集临床尿样约10m,l置-78保存。
样品测定时,取冻存样品室温下解冻,备用。
1.5标准储备溶液的制备
标准储备溶液:
精密称取三聚氰胺、三聚氰酸标准品适量,分别用乙腈-水（11制成0.10mg/ml的标准储备溶液。
再分别用水稀释成0.50g/ml、2.50g/ml、10.0g/ml的标准应用液,用于配制标准曲线和质控样品。
内标溶液:
分别精密称取三聚氰胺-15
N3、三聚氰酸-
13
C3
标准品适量,用乙腈-水（11制成0.10mg/ml的储备溶液,
再用水分别稀释至10g/ml、25g/ml。
1.6样品处理
取尿液0.50ml于1.5ml离心管中,加入三聚氰胺内标溶液（10g/ml和三聚氰酸内标溶液（25g/ml各20,l涡旋振荡30s,加乙腈0.5m,l涡旋振荡30s,密塞,高速离心（14000r/min2min,取上清液供LC-APCI-MS/MS分析。
1.7空白样品、标准曲线和质控样品的制备
空白尿液:
取6个不同个体来源的空白尿液,混匀,作为标准曲线和质控用空白尿液。
空白样品:
取空白尿液0.50ml于1.5ml离心管中,加乙腈0.50m,l涡旋振荡30s,密塞,高速离心（14000r/min2min,取上清液供LC-APCI-MS/MS分析。
标准曲线:
取空白尿液0.50ml于6个1.5ml离心管中,分别加入三聚氰胺、三聚氰酸标准溶液（0.50g/ml、2.50g/ml、10.0g/ml适量,涡旋振荡30s,静置10min,使添加浓度为20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/m,l余同样品处理方法处理后进样分析。
质控样品:
同标准曲线的制备方法制备3个添加浓度（20ng/ml、100ng/ml、900ng/ml的质控样品,余同样品处理方法处理后进样分析。
2实验结果2.1专属性
在所采用条件下,三聚氰胺和三聚氰酸的保留时间分别为5.6min和8.9min,空白样品不干扰三聚氰胺和三聚氰酸
（。
1.三聚氰胺;
2.三聚氰胺内标;
3.三聚氰酸;
4.三聚氰酸内标A:
空白尿液添加三聚氰胺（含三聚氰胺50ng/ml,B:
三聚氰胺尿液样品（含三聚氰胺98ng/ml,C:
三聚氰胺空白尿液,D:
空白尿液添加三聚氰酸（含三聚氰酸50ng/ml,E:
三聚氰酸尿液样品（含三聚氰酸23ng/ml,F:
三聚氰酸空白尿液
图1三聚氰胺和三聚氰酸的色谱图
2.2标准曲线和定量下限（LLOQ
以浓度为横坐标,待测物与内标的峰面积比为纵坐标,以
1/X2为权重系数进行线性回归,得回归方程:
三聚氰胺Y=0.00295X-0.00906,r=0.9991;
三聚氰酸Y=0.000536+0.0151,r=0.9989。
结果表明,三聚氰胺和三聚氰酸均在20ng/ml~1000ng/ml范围内线性关系良好。
LLOQ为10倍信噪比时样品中待测组分的浓度,结果三聚氰胺和三聚氰酸的LLOQ均为20ng/ml。
2702中国卫生检验杂志2010年11月第20卷第11期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Nov2010;
Vol20No11
2.3精密度和准确度试验
取低、中、高质控样品,分别在同一天内（n=6和不同天内（n=3按上述样品处理方法处理后进样分析。
计算批内、批间精密度和准确度,结果见表1。
表1尿液中三聚氰胺和三聚氰酸测定的精密度和准确度试验
理论浓度（ng/ml方法回收率（%
（s
提取回收率（%
批内RSD（%
（n=6
批间RSD（%（n=18
三聚氰胺20102.78.5101.78.88.99.2
10096.45.997.55.86.06.4
900102.34.298.14.34.34.7
三聚氰酸2098.68.498.48.58.68.9
10098.55.599.25.65.65.9
900100.23.5100.23.63.53.7
2.4提取回收率试验
样品:
取低、中、高浓度质控样品各6份,各取0.50ml于1.5ml离心管中,加乙腈0.5m,l涡旋振荡30s,高速离心（14000r/min2min,取上清液0.8m,l加入三聚氰胺内标溶液（10g/ml和三聚氰酸内标溶液（25g/ml各20,l涡旋振荡30s,进样分析。
计算待测物与其内标的峰面积比,计为R
s
。
对照:
以水代替空白尿液同法处理。
计算待测物与其内
标的峰面积比,计为R
c
计算Rs/R
的比值,求得回收率。
结果回收率均在
89.9%~110.5%之间,平均值及其偏差见表1。
2.5稳定性试验
2.5.1供试品溶液的稳定性取低、中、高浓度质控样品,按样品处理方法操作,取待测上清液放置0、1h、2h、4h、8h、
12h后进样分析,结果表明供试品溶液可稳定12h（见表2。
2.5.2样品室温放置的稳定性取低、中、高浓度质控样品,室温放置0、3h、6h、9h、12h后按样品处理方法操作,结果表明样品室温下可稳定12h（见表2。
表2尿液中三聚氰胺和三聚氰酸稳定性试验结果
（以理论浓度的百分比表示
理论浓度（ng/ml供试品溶液室温下
稳定性（%（xs
尿液样品室温下
冻融样品的稳定性（%（xs
三聚氰胺20100.18.498.58.7101.48.610098.96.299.65.799.56.4900100.24.398.14.098.64.4三聚氰酸2098.38.6102.18.6101.48.710099.85.397.54.799.25.090097.93.9100.14.0100.84.0
2.5.3冻融稳定性试验取低、中、高浓度质控样品进行冻融试验（反复冻融1、2、3次,并与未冻融的质控样品进行比较,结果表明冻融稳定性良好（见表2。
2.6样品测定
对批可幼儿样品定,结果有51批样品检出三聚氰胺,含量在22ng/ml~978ng/ml之间;
有21批样品检出三聚氰酸,含量在23ng/ml~199ng/ml之间;
有16批样品同时检出三聚氰胺和三聚氰酸,两者含量之间无明显相关性。
3讨论
3.1质谱条件的优化
3.1.1离子化源的选择LC-MS/MS法常用的离子化源有电喷雾离子化源（ESI源和APCI源。
若采用ESI源,可能产生基质抑制效应、继而产生灵敏度差的问题[9];
若采用APCI源,基质抑制效应可明显改善[10],且可直接用于尿液样品的分析[11]。
本文曾采用ESI源进行测定,结果三聚氰酸响应差;
改用APCI源测定,三聚氰酸灵敏度明显增强,故选择APCI源进行测定。
3.1.2其它质谱条件的优化利用注射泵以30l/min流速分别将10.0g/ml的三聚氰胺和三聚氰酸标准溶液及其相应内标溶液通过三通管汇合流速为0.8ml/min的流动相注入到离子源中,分别在正负离子模式下扫描,结果得到各待测组分的准分子离子峰。
然后对各准分子离子峰分别进行DP扫描,选择响应最高的DP值后再进行子离子扫描,得到碎片离子信息。
在MRM模式下,对各个子离子的CE值进行扫描,选取响应最高的CE值后再分别对CAD、CUR、GS1、TEM、IS、NC等参数进行优化,使三聚氰胺和三聚氰酸的响应达到最佳状态。
NC值的变化可同时显著影响待测组分和噪音的响应大小,故NC值的优化需以信噪比作为考察指标。
对三聚氰胺和三聚氰酸分别选择两对监测离子对,选取干扰小、信噪比大的离子对作为定量离子对。
3.2色谱条件的优化
3.2.1色谱柱的选择分别采用WatersAtlantisHILIC色谱柱（3m,2.1150mm和WatersXBridgeTMAmide色谱柱（3.5m,4.6250mm进行分析,结果在HILIC色谱柱上,三聚氰酸保留时间短,响应差;
改用Amide色谱柱后,三聚氰酸保留时间增加,响应较好。
故选用Amide色谱柱作进一步分析。
3.2.2流动相的优化以WatersXBridgeTMAmide色谱柱（3.5m,4.6250mm为分析柱,分别采用流动相[乙腈-10mmol/L甲酸铵水溶液（8020]、流动相[乙腈-0.1%甲酸水溶液（8020]进行测定,结果在流动相下,三聚氰酸保留时间为5.9min,三聚氰胺在15min内未出峰。
在流动相下,保留时间如图1所示。
根据上述结果,对甲酸铵的浓度进行优化,结果浓度在5mmol/L~20mmol/L时,三聚氰胺和三聚氰酸的保留时间和响应均无明显变化。
流动相中乙腈的比例对保留时间有较大影响。
分别采用不同比例的乙腈（70%、80%、90%进行考察,结果含90%乙腈时,三聚氰胺保留时间偏长;
含70%乙腈时,三聚氰胺与三聚氰酸色谱峰之间的分离度较差,不利于正负离子切换扫描;
含80%乙腈时,保留时间适中,分离度好,无干扰。
故最终选择流动相作为流动相。
3.3样品前处理方法的优化
为了改善峰形,在样品中加入一倍量的乙腈进行稀释。
为了尽可能地减少基质效应的影响,对三聚氰胺和三聚（下转第页2703
后做进一步的观察和研究。
因此,泌尿科医生在患者发热后,应先考虑送血培养,而不是先使用抗生素,这在一定程度上可避免因抗生素的滥用而引起的血流感染的发生。
此外,患者老龄化（平均年龄65岁及均患有不同程度的高血压、心脏病、糖尿病等基础病,也是更易发生血流感染的原因之一。
血培养阳性菌群分布以革兰阴性菌为主,大肠埃希菌占47.2%,这是因为泌尿外科患者术前常伴有革兰阴性菌引起的泌尿系感染,同时由于患者自身、手术等原因使定植于泌尿系的致病菌可通过局部病灶进入血液,从而导致血流感染。
36例培养阳性病例中未检出鲍曼不动杆菌,这说明鲍曼不动杆菌不是引起泌尿外科住院患者血流感染的主要致病菌。
总之,控制医院内血流感染是一个复杂工程,需要采取多方位、多角度的手段,严格的消毒隔离、规范化的操作和患者个人状态的调整等都将对降低泌尿科住院患者血流感染的发生起到积极作用;
积极治疗原发疾病,去除可能的诱发因素,注意无菌操作,合理使用抗菌药物是减少血流感染发生率、提高治愈率的关键。
[参考文献]
[1]BournetonO,MutelT,HeranneyD,etal.Incidenceof
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