基因工程PCRRRSVS7文档格式.docx

1、7载体的酶切方案：pGEX系列上的MCS上的酶切位点在RRSV-S7目的基因序列除Xho1酶存在以外，其他均不存在，可以选用。Smal产生的为平末端,不适合采用考虑到酶切位点的位置效应，选取BamH1与EcoR1作为双酶切位点同尾酶分析，BamH1与EcoR1是非同尾酶为保证两个酶切位点的正确读框，选择PGEX-6P-1作为载体查表得两种酶有通用缓冲液1 x K，BamH1的酶切温度是30度,EcoR1酶切温度为37度两种酶的保护碱基不长设计酶切方案：K buf, 30oC, BamH 1酶切2 hours以上；再37oC加EcoR 1 酶切过夜引物设计图示为软件设计引物ATGGACGAGCT

2、AACTTTATCTCCCTCGACGGGAGGCCCAAP+验证：证明正确 经过人工加上酶切位点，保护碱基最终引物P+（BamH1）5 CGGGATCCATGGACGAGCTAACTTTATC3P-（EcoR1） 5 GGAATTCTCCCTCGACGGGAGGCCCAA3送公司合成, 2 OD, 1OD/tube分装.使用时加ddH2O至10 pmol/ul浓度.实验设计实验步骤：一、RRSV-S7基因抽提RRSV感染的病稻,切碎研磨,加入抽提缓冲液，加入酚,裂解细胞,变性蛋白，离心,得上清（含DNA, mRNA, dsRNA等核酸）。CF11柱可以特异吸附dsRNA，获得纯化的dsRNA

3、,电泳鉴定。二、RT-PCR扩增1.dsRNA, P+,P-混合物, 加热1000C 5min，2.快速插入冰中，3. 加入RT缓冲液和RTase,反应1h，4. 取部分RT产物,作为PCR反应的底物,配好PCR反应体系,PCR扩增，电泳鉴定。三、PCR程序：1.变性：94,5 min 循环过程（30次左右）2.解链：94 , 30s3.引物结合: 5055 ，30s4.延伸：72 ，2 min （ORF的长度为1826bp）5.终延伸：72 ，10 min四、质粒的抽提：配制如下溶液溶液1：50mmol/l 葡萄糖，25mmol/lTriCl （pH 8.0），10 m mol/l EDTA

4、 （pH 8.0）溶液2：0.2 mol/ NaOH，1% SDS溶液3：7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6） 其它溶液：（1）2M NH4AC （2）异丙醇（3）70乙醇 （4） RNase抽提步骤如下：1） 1.5 ml 菌液，12000 rpm* 1 min, 弃上清，溶液1 （200 ul）, 剧烈混匀，溶液2 （400 ul），温柔混匀，冰中5 min;溶液3 （300 ul）, 温柔混匀，冰中10 min2） 13000 rpm* 5 min, 取上清；3） 540 ul 异丙醇， 室温 10 min;4） 14000 rpm * 10 min, 弃上清；5） 100

5、ul 2M NH4AC6） 13000 rpm* 5 min, 取上清；7） 100 ul 异丙醇，室温10 min;8） 14000 rpm * 10 min, 弃上清；9） 70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；10） 烘干10-30 min11） 50 ul ddH2O （含0.1 mg/ ml RNase）, 37C* 30 min.五、基因酶切方案：BamH 1与EcoR 1双酶切PGEX-6P-1质粒六、目的基因与质粒进行连接反应总体积为10ul；基因/载体=1：10；16 连接过夜。七、感受态细胞的制备1. 菌种活化2.取0.5ml菌液至50m

6、l LB培养液中；3、37 ，振荡培养2h至对数期；4、转至50 ml无菌塑料管， 0 *10 min;5、5000 rpm *10 min * 4 6、取沉淀，加25ml 50mM CaCl2【0 ，无菌】7、 5000 rpm *10 min * 4 8、取沉淀, 加 2 ml 含15甘油的50 mM CaCl2重悬，200 ul/tube分装，液氮速冻后至80 冰箱保存。八、质粒与感受态细胞连接将连接产物5 ul加入感受态细胞中混匀冰上30min42 , 90 s冰上12min加1ml LB （无 Amp ）37 培养6000rpm*30s，浓缩100ul涂板（Amp板）37 培养过夜九、阳性菌筛选1. 将菌液涂布与Amp的培养基中， 在培养基中，用牙签随机挑选6个菌落进行克隆的Amp抗性筛选，已导入载体的感受态细胞存活。2.在培养基中，随机挑选6个菌落进行PCR筛选，目的基因长度为1824bp3. BamH 1与EcoR 1双酶切电泳筛选4.将含有目的基因的重组质粒送往公司进行测序。十、蛋白的表达纯化1、破碎生物组织，用适当的缓冲液将蛋白质抽提2、离心法将细胞的亚细胞结构和细胞碎片与溶液分开3、盐析法将相关蛋白质组分沉淀4、色谱法或电泳法使各种蛋白质分开，纯化十一、蛋白功能研究