基因工程PCRRRSVS7文档格式.docx
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7载体的酶切方案:
pGEX系列上的MCS上的酶切位点在RRSV-S7目的基因序列除Xho1酶存在以外,其他均不存在,可以选用。
SmalⅠ产生的为平末端,不适合采用
考虑到酶切位点的位置效应,选取BamH1与EcoR1作为双酶切位点
同尾酶分析,BamH1与EcoR1是非同尾酶
为保证两个酶切位点的正确读框,选择PGEX-6P-1作为载体
查表得两种酶有通用缓冲液1xK,BamH1的酶切温度是30度,EcoR1酶切温度为37度
两种酶的保护碱基不长
设计酶切方案:
Kbuf,30oC,BamH1酶切2hours以上;
再37oC加EcoR1酶切过夜
引物设计
图示为软件设计引物
ATGGACGAGCTAACTTTATC
TCCCTCGACGGGAGGCCCAA
P+验证:
证明正确
经过人工加上酶切位点,保护碱基最终引物
P+(BamH1)5’CGGGATCCATGGACGAGCTAACTTTATC3’
P-(EcoR1)5’GGAATTCTCCCTCGACGGGAGGCCCAA3’
送公司合成,2OD,1OD/tube分装.
使用时加ddH2O至10pmol/ul浓度.
实验设计
实验步骤:
一、RRSV-S7基因抽提
RRSV感染的病稻,切碎研磨,加入抽提缓冲液,加入酚,裂解细胞,变性蛋白,离心,得上清(含DNA,mRNA,dsRNA等核酸)。
CF11柱可以特异吸附dsRNA,获得纯化的dsRNA,电泳鉴定。
二、RT-PCR扩增
1.dsRNA,P+,P-混合物,加热1000C5min,
2.快速插入冰中,
3.加入RT缓冲液和RTase,反应1h,
4.取部分RT产物,作为PCR反应的底物,配好PCR反应体系,PCR扩增,电泳鉴定。
三、PCR程序:
1.变性:
94℃,5min
循环过程(30次左右)
2.解链:
94℃,30s
3.引物结合:
50~55℃,30s
4.延伸:
72℃,2min(ORF的长度为1826bp)
5.终延伸:
72℃,10min
四、质粒的抽提:
配制如下溶液
溶液1:
50mmol/l葡萄糖,25mmol/lTri·
Cl(pH8.0),10mmol/lEDTA(pH8.0)
溶液2:
0.2mol/NaOH,1%SDS
溶液3:
7.5mol/LNH4AC(pH7.6)
其它溶液:
(1)2MNH4AC
(2)异丙醇(3)70%乙醇(4)RNase
抽提步骤如下:
1)1.5ml菌液,12000rpm*1min,弃上清,溶液1(200ul),剧烈混匀,溶液2(400ul),温柔混匀,冰中5min;
溶液3(300ul),温柔混匀,冰中10min
2)13000rpm*5min,取上清;
3)540ul异丙醇,室温10min;
4)14000rpm*10min,弃上清;
5)100ul2MNH4AC
6)13000rpm*5min,取上清;
7)100ul异丙醇,室温10min;
8)14000rpm*10min,弃上清;
9)70%乙醇500ul,14000rpm*10min,弃上清;
10)烘干10-30min
11)50ulddH2O(含0.1mg/mlRNase),37°
C*30min.
五、基因酶切方案:
BamH1与EcoR1双酶切PGEX-6P-1质粒
六、目的基因与质粒进行连接
反应总体积为10ul;
基因/载体=1:
10;
16℃连接过夜。
七、感受态细胞的制备
1.菌种活化
2.取0.5ml菌液至50mlLB培养液中;
3、37℃,振荡培养2h至对数期;
4、转至50ml无菌塑料管,0℃*10min;
5、5000rpm*10min*4℃
6、取沉淀,加25ml50mMCaCl2【0℃,无菌】
7、5000rpm*10min*4℃
8、取沉淀,加2ml含15%甘油的50mMCaCl2重悬,200ul/tube分装,液氮速冻后至-80℃冰箱保存。
八、质粒与感受态细胞连接
将连接产物5ul加入感受态细胞中混匀
冰上30min
42℃,90s
冰上1~2min
加1mlLB(无Amp)
37℃培养
6000rpm*30s,浓缩100ul
涂板(Amp板)
37℃培养过夜
九、阳性菌筛选
1.将菌液涂布与Amp的培养基中,在培养基中,用牙签随机挑选6个菌落进行克隆的Amp抗性筛选,已导入载体的感受态细胞存活。
2.在培养基中,随机挑选6个菌落进行PCR筛选,目的基因长度为1824bp
3.BamH1与EcoR1双酶切电泳筛选
4.将含有目的基因的重组质粒送往公司进行测序。
十、蛋白的表达纯化
1、破碎生物组织,用适当的缓冲液将蛋白质抽提
2、离心法将细胞的亚细胞结构和细胞碎片与溶液分开
3、盐析法将相关蛋白质组分沉淀
4、色谱法或电泳法使各种蛋白质分开,纯化
十一、蛋白功能研究