9研制报告Word格式.docx

1、3.1.4 37孵箱 上海跃进医疗器械厂3.1.5 HPLC （日本岛津公司）3.2. 主要原材料3.2.1. 专用原材料抗NSE单克隆抗体购于北京中检维康公司。NSE抗原购于北京中检维康公司。Eu-DTTA：N1-（P-异硫氰基苄基）-二乙三胺四乙酸铕钠，分子量：653.43，分子式：C20H22N4O8SEuNa （每一分子连接一个铕离子），含量：96%以上（HPLC分析），中国医学科学院放射医学研究所制备；BSA，上海生工生物工程公司。微孔反应条（812）：CV（%）应10%，深圳金灿华公司。3.2.2. 化学原料Tris（三羟甲基氨基甲烷） 进口/国产盐酸 G.R 上海化学试剂公司鸡冠

2、花红 A.R 上海三爱思试剂有限公司叠氮钠 G.R 上海生工生物工程有限公司牛-球蛋白 SIGMATween20 上海生工生物工程有限公司BSA 进口/上海普龙生物技术研发有限公司无水碳酸钠 A.R 上海虹光化工厂碳酸氢钠 A.R 上海虹光化工厂氯化钠 G.R 上海化学试剂公司醋酸钠 A.R 上海三浦化工有限公司醋酸 A.R 上海化学试剂公司乙二胺四乙酸二钠（EDTA） A.R 上海化学试剂公司3.2.3 实验用标准品与标本3.2.3.1 企业标准品：自制，Roche NSE ECLIA校正其浓度。3.2.3.2 NSE校准品：用缓冲液将NSE抗原浓缩液稀释至一系列浓度梯度，用企业标准品校正。

3、4实验方法4.1 原料制备分析4.1.1 Eu-DTTA纯度分析与鉴定4.1.1.1 紫外分析（UV） 测试条件：溶剂为水，波长280nm4.1.1.2 红外分析（IR）4.1.1.3 HPLC分析 波长：254nm，溶剂30甲醇。4.1.2 铕标记抗NSE单克隆抗体（McAb-Eu）制备4.1.2.1 铕标记物1mg Eu-DTTA用200ul pH 9.6 0.05M碳酸缓冲液溶解。加入抗NSE McAb 5mg，充分混匀，室温静置约36小时。4.1.2.2 纯化取铕标记物过Sephadex G50（上10cm）-Sepharose 6B（下30cm）层析柱。用0.05M pH 7.8 T

4、ris-HCl缓冲液洗脱，收集蛋白峰各管合并。4.1.2.3 保存铕标记物加入0.1-1%BSA，混匀置2-8保存。4.2 NSE TRIFMA试剂盒各组分制备4.2.1抗-NSE包被反应板的制备1）. 包被液的配制a）. 配制0.05M pH9.6碳酸缓冲液（碳酸钠1.6g, 碳酸氢钠2.9g, 去离子水至1000ml）。b）. 将抗NSE McAb按终浓度约5 ug/ml加至0.05M pH9.6碳酸缓冲液中，混匀。2）. 封闭液的配制Tris 6.06g，HCl 3.0ml，NaCl 9g，NaN3 0.5g，BSA 10g，去离子水至1000ml。3）. 包被抗-NSEa） 取微孔反应

5、板每孔加入包被液100ul，室温24小时。b） 洗涤：以包被机或洗板机吸干包被液，注入洗涤液350ul/孔，立即吸干，重复2次。c） 封闭：注入封闭液150ul/孔，室温12小时。d） 甩干：甩干封闭液，将板子放入甩干机甩干5分钟。e） 冻干：打开冻干机，打开冷凝器制冷，使箱体内温度保持在-45以下，将板子放入机箱，打开蝶阀，然后打开真空泵，保温3h，停机，出板。e） 反应板包装：将冻干后反应板装入锡铂袋并热封置2-8保存。4.2.2 铕标记物溶液的制备取一定量的抗NSE McAb-Eu，加铕标记稀释液至最终工作浓度的20倍，分装，加盖封口，2-8保存。4.2.3 NSE校准品的制备用缓冲液将

6、NSE浓缩液稀释成A、B、C、D、E、F六个标准点（浓度分别约0、1、5、20、100、500ng/ml），分装，冷冻干燥，以企业标准品校正。于28保存。4.2.4 增强液的制备无水乙醇 1ml-NTA 4mgTOPO 20mg冰醋酸 6ml邻苯二甲酸氢钾 14gTriton-x100 1ml三蒸水至 1000ml4.2.5 浓缩洗液的制备Tris 600gNaCl 450gTween-20 10mlNaN3 25g三蒸水至 2000ml4.2.6 铕标记保存液的制备Tris 6.06gBSA 3gNaCl 9gNaN3 0.5g去离子水至 1000mL充分混匀后，用HCl调整pH至7.8，稀

7、释抗NSE McAb-Eu；分装，2-8保存。4.2.7 分析缓冲液的配制BSA 20gTween-20 1mlEDTA-Na2 14.88mg小鼠血清 1.5ml牛IgG 0.5gNaN3 1.0g鸡冠花红 0.05g去离子水至 1000mL充分混匀后，用HCl调整pH至7.8，分装，2-8保存。5、 NSE TRIFMA试剂盒操作步骤5.1试剂的准备5.1.1 洗涤液：将40ml浓缩洗液和960ml去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工作洗涤液备用。5.1.2 校准品：在校准品各点中分别加入0.5ml去离子水，静置10分钟，混匀后使用。5.1.3 铕标记：使用前一小时内，用分析缓冲液按1:2

8、0稀释铕标记物。5.2. 操作步骤5.2.1 将试剂盒内分析缓冲液、校准品、所需数量的微孔反应条和待测样品平衡至室温（2025）。5.2.2 吸取25l的校准品和样品，按顺序加入相应微孔。5.2.3 在各微孔内加入100l已稀释的铕标记溶液，在室温下于慢档振动60分钟。5.2.4 洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。5.2.5 在每个微孔内加入100l的增强液，于慢档振动5分钟。5.2.6 用时间分辨荧光测定仪检测。5.3. 结果判断5.3.1 结果测定：用本公司ANYTEST2000时间分辨荧光测定仪或WALLAC公司的各型时间分辨荧光检测仪测量时，检查程序的参数是否如下所示。如不符，请修

9、改。ASSAY TYPE（分析类型）：IFMA（时间分辨免疫荧光分析法）FITTING METHOD（曲线拟和方式）：SPLINE SMOOTHED（平滑样条函数）X-AXIS（X轴）：LOGY-AXIS（Y轴）：LOG-BBLANKS（背景孔数）：2STANDARDS（校准品）：5STANDARDS REPLICATES（校准品复孔数）：STANDARD CONC（校准品浓度）：BCDEFUNKNOWN REPLICATES（待测样品孔数）：15.3.2 质量控制：校准品A点荧光强度不高于5000，F点荧光强度不低于1200000。否则重新实验。6、NSE TRIFMA试剂盒生产工艺的确定6

10、.1 NSE包被浓度的选择6.1.1 抗NSE-McAb按最终浓度为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml进行包被，测量各校准点的荧光强度。6.1.2 铕标记物使用浓度为400ng/ml。6.2铕标记条件和使用浓度的确定6.2.1 Eu-DTTA与抗NSE配比的选择6.2.2.1 Eu-DTTA与抗NSE配比为：1mg：2mg、1mg：5mg、1mg：10mg，按4.1.2标记、分离McAb-Eu。6.2.2.2 使用上述不同配比的McAb-Eu，按操作步骤制作NSE TRIFMA校准曲线和测定质控品浓度值。6.2.2.3 抗NSE包被浓度为5ug/ml。6.2.2 抗NSE McAb

11、-Eu工作浓度的选择6.2.2.1 将抗NSE McAb-Eu配制成200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml，按操作步骤制作NSE TRIFMA校准曲线。6.2.2.2 抗NSE包被浓度为5ug/ml。6.3反应时间的确定选择室温和不同的反应时间，按操作步骤制作NSE TRIFMA标准曲线，并测量低、中、高三种质控品的浓度。6.4 临界值的确定用构建的试剂盒测定504份经Roche NSE ECLIA确诊为阴性的NSE标本，以百分位数法确定试剂盒临界值。7、 NSE TRIFMA诊断试剂盒质量评估7.1 NSE TRIFMA标准曲线按试剂盒使用说明书操作，分别以NSE浓度Log值、

12、荧光强度Log值为横坐标和纵坐标作图，制作NSE TRIFMA标准曲线。7.2 NSE TRIFMA分析灵敏度NSE TRIFMA分析灵敏度规定为：平行测定12次零标准的荧光计数SD的二倍在标准曲线上的对应值。7.3 NSE TRIFMA精密性对NSE质控血清分别于实验内和实验间作测定，分别计算实验内与实验间CV。7.4 质控品符合率对NSE质控血清进行检测，质控血清测量值应在允许的范围内。7.5 相关性比较以本方法对168例有Roche测量值的血清标本进行测量，考察本方法测量值与Roche NSE ECLIA试剂盒测量值之间的相关性。7.6 交叉反应用NSE-TRIFMA试剂盒检测高浓度AF

13、P、CEA、CA125，计算交叉反应。7.7 稳定性试验7.7.1 2-8稳定性：将3个批号的NSE-TRIFMA试剂盒在2-8保存，第6、12个月检测一次。7.7.2 37稳定性：对3个批号的NSE-TRIFMA试剂盒进行37的稳定性实验，在7天、9天分别进行检测。8、实验结果与分析8.1 Eu-DTTA纯度分析与鉴定对Eu-DTTA （中国医科院放射医学研究所制备）的纯度分析与鉴定如下：a） 紫外分析（UV）图谱图2 Eu-DTTA的紫外分析（UV）图b） 红外分析（IR） 图谱图3 Eu-DTTA的红外分析（IR）图c） HPLC纯度分析图4 Eu-DTTA的HPLC纯度分析图由HPLC

14、图谱可见，中国医学科学院放射医学研究所制备的Eu-DTTA纯度不低于96%。红外图谱（IR）：3487 伯胺（NH2） 弯曲振动，尖锐强峰2012 CN 伸缩振动，强度较弱1601 CO 伸缩振动1407、1502 苯环骨架振动紫外图谱（UV）：能测到268nm-280nm的位移可见Eu-DTTA纯度较高，各功能团符合分子结构。8.2 试剂盒生产工艺确定8.2.1 抗NSE-McAb包被浓度的选择固定铕标记物（抗NSE McAb-Eu）终浓度为400ng/ml，以抗NSE McAb浓度分别为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml包被微孔，测量各校准点的荧光强度。表1. 抗-NSE单抗包

15、被浓度对校准品荧光强度的影响包被浓度（g /ml）校准品荧光强度（CPS）0ng/ml1.45ng/ml4.5ng/ml17ng/ml105ng/ml470ng/ml2.511734658153305869242959917127525.01828820724899105295676538323473510.0244110649326531332048826623786789表2. 抗-NSE单抗包被浓度对信噪比的影响3.9713.0750.03366.221460.094.4913.6257.60370.081769.474.3613.3854.58361.651551.55结果显示：包被浓

16、度为5g /ml、10g /ml时，公司NSE各校准点有较高的信噪比，分析灵敏度较高，且在校准品浓度范围内荧光强度线性良好，但当抗体浓度达5g /ml时已基本达到饱和，10g /ml包被浓度较高，原料用量较大，特异荧光强度增高有限，所以选择5g /ml作为包被浓度。8.2.2 Eu-DTTA与标记用抗-NSE单抗最佳标记浓度选择 包被用抗-NSE单抗按最终浓度为5.0g /ml作为包被。 室温下反应60min。 Eu-DTTA与抗-NSE单抗标记浓度比:1mg:2mg、1mg:5mg、1mg:10mg三种。 将以上三种标记条件的Eu-DTTA-抗-NSE，配制成200ng/ml、400ng/m

17、l、800ng/ml三种浓度，检测公司线性校准品的荧光强度。结果见表3，4。表3.Eu-DTTA与抗-NSE单抗用量比与使用浓度选择Eu-DTTA: 5A6浓度ng/ml1:2mg200166866122013781960546920242187740026271132536627142954962901400652780039161346742943177964124765644809975mg12744625136675695437828917471961920834925169102497694231303545827491023134488141144924518381242310mg

18、14182439816528892202640966226200245031392754585367139173883325467946249611061036698812906196表4 Eu-DTTA与抗-NSE单抗用量比与使用浓度对信噪比的影响5A6校准品荧光强度（CPS）/A点荧光强度（CPS）3.9612.0849.15327.961452.264.3113.9454.41366.481524.893.4410.9745.44318.581144.183.6310.7344.71296.981371.664.3513.1153.38361.561580.903.7212.5551.3

19、5336.351387.021.725.7620.37142.89681.322.256.9627.26183.35868.373.129.8041.67263.101141.44结果表明：当Eu-DTTA与9602按1mg/5mg标记，配制成400ng/ml工作浓度时，信噪比最佳，而且校准曲线范围内线性良好，表明Eu-DTTA与抗-NSE单抗按1:5（W/W）标记，工作浓度为400ng/ml时，可得到良好的剂量-反应曲线。8.2.3 反应时间的选择包被用抗-NSE单抗按最终浓度为5.0g/ml作为包被。铕标记物工作浓度为400ng/ml。一步法反应0.5小时、1小时和2小时分别检测公司NSE

20、校准品和NSE公司质控血清。结果见表9。表9 反应时间的比较NSE校准品校准品浓度（ng/ml）1.454.517105470一步法0.5h1268545516450623104193001967603NSE公司质控血清测量值（ng/ml）7.6823.4985.93一步法1h198880462556210589569524231300747.7524.3685.58一步法2h216288632711110865372816833958857.8023.1786.70由表9可以看出：1小时和2小时对校准品的荧光强度没有明显影响，对公司质控血清的测量值也比较一致。反应时间0.5小时的荧光强度偏低

21、很多，不利于低浓度NSE的检测。因此，本工作选用一步法反应1小时。8.2.4 临界值的确定8.2.4.1 标本：所有标本均从医院收集，经过ROCHE NSE CLIA试剂盒检测，确认为阴性。8.2.4.2 用本公司NSE定量检测试剂盒测定504份正常人体检标本的NSE浓度以确定试剂盒正常范围。8.2.4.2.1统计数据表1：表1 统计数据检测浓度值（ng/ml）标本个数0.00-1.001.01-2.002.01-3.0033.01-4.00184.01-5.00535.01-6.00846.01-7.00957.01-8.00768.01-9.00529.01-10.003310.01-11.003111.01-12.002312.01-13.001213.01-14.001114.01-15.00815.01-16.0016.00-17.008.2.4.2.2对上述数据作图，见图1：图1 数据频率分布图由图1可见，数据基本呈偏态分布。8.2.4.2.3统计数据见表2：表2 统计数据检测浓度值频率（%）累计频数累计频率（%）0.000.200.6040.793.57224.37