9研制报告Word格式.docx
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3.1.437℃孵箱上海跃进医疗器械厂
3.1.5HPLC（日本岛津公司）
3.2.主要原材料
3.2.1.专用原材料
抗NSE单克隆抗体购于北京中检维康公司。
NSE抗原购于北京中检维康公司。
Eu-DTTA：
N1-（P-异硫氰基苄基）-二乙三胺四乙酸铕钠，分子量：
653.43，分子式：
C20H22N4O8SEuNa（每一分子连接一个铕离子），含量：
96%以上（HPLC分析），中国医学科学院放射医学研究所制备；
BSA，上海生工生物工程公司。
微孔反应条（8×
12）：
CV（%）应＜10%，深圳金灿华公司。
3.2.2.化学原料
Tris（三羟甲基氨基甲烷）进口/国产
盐酸G.R上海化学试剂公司
鸡冠花红A.R上海三爱思试剂有限公司
叠氮钠G.R上海生工生物工程有限公司
牛γ-球蛋白SIGMA
Tween20上海生工生物工程有限公司
BSA进口/上海普龙生物技术研发有限公司
无水碳酸钠A.R上海虹光化工厂
碳酸氢钠A.R上海虹光化工厂
氯化钠G.R上海化学试剂公司
醋酸钠A.R上海三浦化工有限公司
醋酸A.R上海化学试剂公司
乙二胺四乙酸二钠（EDTA）A.R上海化学试剂公司
3.2.3实验用标准品与标本
3.2.3.1企业标准品：
自制，RocheNSEECLIA校正其浓度。
3.2.3.2NSE校准品：
用缓冲液将NSE抗原浓缩液稀释至一系列浓度梯度，用企业标准品校正。
4．实验方法
4.1原料制备\分析
4.1.1Eu-DTTA纯度分析与鉴定
4.1.1.1紫外分析（UV）测试条件：
溶剂为水，波长280nm
4.1.1.2红外分析（IR）
4.1.1.3HPLC分析波长：
254nm，溶剂30﹪甲醇。
4.1.2铕标记抗NSE单克隆抗体（McAb-Eu）制备
4.1.2.1铕标记物
1mgEu-DTTA用200ulpH9.60.05M碳酸缓冲液溶解。
加入抗NSEMcAb5mg，充分混匀，室温静置约36小时。
4.1.2.2纯化
取铕标记物过SephadexG50（上10cm）-Sepharose6B（下30cm）层析柱。
用0.05MpH7.8Tris-HCl缓冲液洗脱，收集蛋白峰各管合并。
4.1.2.3保存
铕标记物加入0.1-1%BSA，混匀置2-8℃保存。
4.2NSETRIFMA试剂盒各组分制备
4.2.1抗-NSE包被反应板的制备
1）.包被液的配制
a）.配制0.05MpH9.6碳酸缓冲液（碳酸钠1.6g,碳酸氢钠2.9g,去离子水至1000ml）。
b）.将抗NSEMcAb按终浓度约5ug/ml加至0.05MpH9.6碳酸缓冲液中，混匀。
2）.封闭液的配制
Tris6.06g，HCl3.0ml，NaCl9g，NaN30.5g，BSA10g，去离子水至1000ml。
3）.包被抗-NSE
a）取微孔反应板每孔加入包被液100ul，室温～24小时。
b）洗涤：
以包被机或洗板机吸干包被液，注入洗涤液350ul/孔，立即吸干，重复2次。
c）封闭：
注入封闭液150ul/孔，室温～12小时。
d）甩干：
甩干封闭液，将板子放入甩干机甩干5分钟。
e）冻干：
打开冻干机，打开冷凝器制冷，使箱体内温度保持在-45℃以下，将板子放入机箱，打开蝶阀，然后打开真空泵，保温3h，停机，出板。
e）反应板包装：
将冻干后反应板装入锡铂袋并热封置2-8℃保存。
4.2.2铕标记物溶液的制备
取一定量的抗NSEMcAb-Eu，加铕标记稀释液至最终工作浓度的20倍，分装，加盖封口，2-8℃保存。
4.2.3NSE校准品的制备
用缓冲液将NSE浓缩液稀释成A、B、C、D、E、F六个标准点（浓度分别约0、1、5、20、100、500ng/ml），分装，冷冻干燥，以企业标准品校正。
于2～8℃保存。
4.2.4增强液的制备
无水乙醇 1ml
β-NTA 4mg
TOPO 20mg
冰醋酸 6ml
邻苯二甲酸氢钾 14g
Triton-x100 1ml
三蒸水至 1000ml
4.2.5浓缩洗液的制备
Tris600g
NaCl450g
Tween-2010ml
NaN325g
三蒸水至 2000ml
4.2.6铕标记保存液的制备
Tris6.06g
BSA3g
NaCl9g
NaN30.5g
去离子水至1000mL
充分混匀后，用HCl调整pH至7.8，稀释抗NSEMcAb-Eu；
分装，2-8℃保存。
4.2.7分析缓冲液的配制
BSA20g
Tween-201ml
EDTA-Na214.88mg
小鼠血清1.5ml
牛IgG0.5g
NaN31.0g
鸡冠花红0.05g
去离子水至1000mL
充分混匀后，用HCl调整pH至7.8，分装，2-8℃保存。
5、NSETRIFMA试剂盒操作步骤
5.1试剂的准备
5.1.1洗涤液：
将40ml浓缩洗液和960ml去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工作洗涤液备用。
5.1.2校准品：
在校准品各点中分别加入0.5ml去离子水，静置10分钟，混匀后使用。
5.1.3铕标记：
使用前一小时内，用分析缓冲液按1:
20稀释铕标记物。
5.2.操作步骤
5.2.1将试剂盒内分析缓冲液、校准品、所需数量的微孔反应条和待测样品平衡至室温（20～25℃）。
5.2.2吸取25μl的校准品和样品，按顺序加入相应微孔。
5.2.3在各微孔内加入100μl已稀释的铕标记溶液，在室温下于慢档振动60分钟。
5.2.4洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。
5.2.5在每个微孔内加入100μl的增强液，于慢档振动5分钟。
5.2.6用时间分辨荧光测定仪检测。
5.3.结果判断
5.3.1结果测定：
用本公司ANYTEST2000时间分辨荧光测定仪或WALLAC公司的各型时间分辨荧光检测仪测量时，检查程序的参数是否如下所示。
如不符，请修改。
ASSAYTYPE（分析类型）：
IFMA（时间分辨免疫荧光分析法）
FITTINGMETHOD（曲线拟和方式）：
SPLINESMOOTHED（平滑样条函数）
X-AXIS（X轴）：
LOG
Y-AXIS（Y轴）：
LOG-B
BLANKS（背景孔数）：
2
STANDARDS（校准品）：
5
STANDARDSREPLICATES（校准品复孔数）：
STANDARDCONC（校准品浓度）：
B
C
D
E
F
UNKNOWNREPLICATES（待测样品孔数）：
1
5.3.2质量控制：
校准品A点荧光强度不高于5000，F点荧光强度不低于1200000。
否则重新实验。
6、NSETRIFMA试剂盒生产工艺的确定
6.1NSE包被浓度的选择
6.1.1抗NSE-McAb按最终浓度为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml进行包被，测量各校准点的荧光强度。
6.1.2铕标记物使用浓度为400ng/ml。
6.2铕标记条件和使用浓度的确定
6.2.1Eu-DTTA与抗NSE配比的选择
6.2.2.1Eu-DTTA与抗NSE配比为：
1mg：
2mg、1mg：
5mg、1mg：
10mg，按4.1.2标记、分离McAb-Eu。
6.2.2.2使用上述不同配比的McAb-Eu，按操作步骤制作NSETRIFMA校准曲线和测定质控品浓度值。
6.2.2.3抗NSE包被浓度为5ug/ml。
6.2.2抗NSEMcAb-Eu工作浓度的选择
6.2.2.1将抗NSEMcAb-Eu配制成200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml，按操作步骤制作NSETRIFMA校准曲线。
6.2.2.2抗NSE包被浓度为5ug/ml。
6.3反应时间的确定
选择室温和不同的反应时间，按操作步骤制作NSETRIFMA标准曲线，并测量低、中、高三种质控品的浓度。
6.4临界值的确定
用构建的试剂盒测定504份经RocheNSEECLIA确诊为阴性的NSE标本，以百分位数法确定试剂盒临界值。
7、NSETRIFMA诊断试剂盒质量评估
7.1NSETRIFMA标准曲线
按试剂盒使用说明书操作，分别以NSE浓度Log值、荧光强度Log值为横坐标和纵坐标作图，制作NSETRIFMA标准曲线。
7.2NSETRIFMA分析灵敏度
NSETRIFMA分析灵敏度规定为：
平行测定12次零标准的荧光计数SD的二倍在标准曲线上的对应值。
7.3NSETRIFMA精密性
对NSE质控血清分别于实验内和实验间作测定，分别计算实验内与实验间CV。
7.4质控品符合率
对NSE质控血清进行检测，质控血清测量值应在允许的范围内。
7.5相关性比较
以本方法对168例有Roche测量值的血清标本进行测量，考察本方法测量值与RocheNSEECLIA试剂盒测量值之间的相关性。
7.6交叉反应
用NSE-TRIFMA试剂盒检测高浓度AFP、CEA、CA125，计算交叉反应。
7.7稳定性试验
7.7.12-8℃稳定性：
将3个批号的NSE-TRIFMA试剂盒在2-8℃保存，第6、12个月检测一次。
7.7.237℃稳定性：
对3个批号的NSE-TRIFMA试剂盒进行37℃的稳定性实验，在7天、9天分别进行检测。
8、实验结果与分析
8.1Eu-DTTA纯度分析与鉴定
对Eu-DTTA（中国医科院放射医学研究所制备）的纯度分析与鉴定如下：
a）紫外分析（UV）图谱
图2Eu-DTTA的紫外分析（UV）图
b）红外分析（IR）图谱
图3Eu-DTTA的红外分析（IR）图
c）HPLC纯度分析
图4Eu-DTTA的HPLC纯度分析图
由HPLC图谱可见，中国医学科学院放射医学研究所制备的Eu-DTTA纯度不低于96%。
红外图谱（IR）：
3487伯胺（NH2）弯曲振动，尖锐强峰
2012C≡N伸缩振动，强度较弱
1601C＝O伸缩振动
1407、1502苯环骨架振动
紫外图谱（UV）：
能测到268nm-280nm的位移
可见Eu-DTTA纯度较高，各功能团符合分子结构。
8.2试剂盒生产工艺确定
8.2.1抗NSE-McAb包被浓度的选择
固定铕标记物（抗NSEMcAb-Eu）终浓度为400ng/ml，以抗NSEMcAb浓度分别为2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml包被微孔，测量各校准点的荧光强度。
表1.抗-NSE单抗包被浓度对校准品荧光强度的影响
包被浓度（μg/ml）
校准品荧光强度（CPS）
0ng/ml
1.45ng/ml
4.5ng/ml
17ng/ml
105ng/ml
470ng/ml
2.5
1173
4658
15330
58692
429599
1712752
5.0
1828
8207
24899
105295
676538
3234735
10.0
2441
10649
32653
133204
882662
3786789
表2.抗-NSE单抗包被浓度对信噪比的影响
3.97
13.07
50.03
366.22
1460.09
4.49
13.62
57.60
370.08
1769.47
4.36
13.38
54.58
361.65
1551.55
结果显示：
包被浓度为5μg/ml、10μg/ml时，公司NSE各校准点有较高的信噪比，分析灵敏度较高，且在校准品浓度范围内荧光强度线性良好，但当抗体浓度达5μg/ml时已基本达到饱和，10μg/ml包被浓度较高，原料用量较大，特异荧光强度增高有限，所以选择5μg/ml作为包被浓度。
8.2.2Eu-DTTA与标记用抗-NSE单抗最佳标记浓度选择
①包被用抗-NSE单抗按最终浓度为5.0μg/ml作为包被。
②室温下反应60min。
③Eu-DTTA与抗-NSE单抗标记浓度比:
1mg:
2mg、1mg:
5mg、1mg:
10mg三种。
④将以上三种标记条件的Eu-DTTA-抗-NSE，配制成200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml三种浓度，检测公司线性校准品的荧光强度。
结果见表3，4。
表3.Eu-DTTA与抗-NSE单抗用量比与使用浓度选择
Eu-DTTA:
5A6
浓度ng/ml
1:
2mg
200
1668
6612
20137
81960
546920
2421877
400
2627
11325
36627
142954
962901
4006527
800
3916
13467
42943
177964
1247656
4480997
5mg
1274
4625
13667
56954
378289
1747196
1920
8349
25169
102497
694231
3035458
2749
10231
34488
141144
924518
3812423
10mg
1418
2439
8165
28892
202640
966226
2002
4503
13927
54585
367139
1738833
2546
7946
24961
106103
669881
2906196
表4Eu-DTTA与抗-NSE单抗用量比与使用浓度对信噪比的影响
5A6
校准品荧光强度（CPS）/A点荧光强度（CPS）
3.96
12.08
49.15
327.96
1452.26
4.31
13.94
54.41
366.48
1524.89
3.44
10.97
45.44
318.58
1144.18
3.63
10.73
44.71
296.98
1371.66
4.35
13.11
53.38
361.56
1580.90
3.72
12.55
51.35
336.35
1387.02
1.72
5.76
20.37
142.89
681.32
2.25
6.96
27.26
183.35
868.37
3.12
9.80
41.67
263.10
1141.44
结果表明：
当Eu-DTTA与9602按1mg/5mg标记，配制成400ng/ml工作浓度时，信噪比最佳，而且校准曲线范围内线性良好，表明Eu-DTTA与抗-NSE单抗按1:
5（W/W）标记，工作浓度为400ng/ml时，可得到良好的剂量-反应曲线。
8.2.3反应时间的选择
①包被用抗-NSE单抗按最终浓度为5.0μg/ml作为包被。
②铕标记物工作浓度为400ng/ml。
③一步法反应0.5小时、1小时和2小时分别检测公司NSE校准品和NSE公司质控血清。
④结果见表9。
表9反应时间的比较
NSE校准品
校准品浓度（ng/ml）
1.45
4.5
17
105
470
一步法0.5h
1268
5455
16450
62310
419300
1967603
NSE公司质控血清测量值（ng/ml）
7.68
23.49
85.93
一步法1h
1988
8046
25562
105895
695242
3130074
7.75
24.36
85.58
一步法2h
2162
8863
27111
108653
728168
3395885
7.80
23.17
86.70
由表9可以看出：
1小时和2小时对校准品的荧光强度没有明显影响，对公司质控血清的测量值也比较一致。
反应时间0.5小时的荧光强度偏低很多，不利于低浓度NSE的检测。
因此，本工作选用一步法反应1小时。
8.2.4临界值的确定
8.2.4.1标本：
所有标本均从医院收集，经过ROCHENSECLIA试剂盒检测，确认为阴性。
8.2.4.2用本公司NSE定量检测试剂盒测定504份正常人体检标本的NSE浓度以确定试剂盒正常范围。
8.2.4.2.1统计数据表1：
表1统计数据
检测浓度值（ng/ml）
标本个数
0.00-1.00
1.01-2.00
2.01-3.00
3
3.01-4.00
18
4.01-5.00
53
5.01-6.00
84
6.01-7.00
95
7.01-8.00
76
8.01-9.00
52
9.01-10.00
33
10.01-11.00
31
11.01-12.00
23
12.01-13.00
12
13.01-14.00
11
14.01-15.00
8
15.01-16.00
16.00-17.00
8.2.4.2.2对上述数据作图，见图1：
图1数据频率分布图
由图1可见，数据基本呈偏态分布。
8.2.4.2.3统计数据见表2：
表2统计数据
检测浓度值
频率（%）
累计频数
累计频率（%）
0.00
0.20
0.60
4
0.79
3.57
22
4.37
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