基于正交实验优化创伤弧菌金属蛋白酶融合蛋白的表达Word文件下载.docx

1、金属蛋白酶；正交设计；直观分析；方 差分析Abstract Objective: To optimize the expressi on ofrecomb inant metalloprotease of Vvibrio vulni ficus inE.coliBL21/DE3 in duced by IPTG. Method: The plasmid ofpET-32a-vvp/E.coliBL21 was constructed by our laboratory. Four different factors,including time, temperature, agitation

2、speed and concentration of IPTG, were studied by orthogonal experimental desig n. The data were an alyzed by direct calculatio n and ANOVA method. Results: The R value of agitati on rate result ing from direct calculation was highest among four factors. The P value of agitati on rate was lower tha n

3、 0.05. The P value of the other factors were higher than 0.05. Conclusions: The expression level is remarkable affected by the agitatio n rate. The expressi on level of VVP protein is highest when agitation rate is 250 rpm. Therefore we have established a method for high-level expression of VVP-four

4、 hours-inducing time, 37 C -inducing temperature, 1mmol/Lconcentration of IPTG and agitation rate in 250rpm.Key words vibrio vulni ficus; metalloprotease; orthogo nal experime ntal desig n; direct an alysis; an alysis of varia nce（ANOVA） 很多临床病例及动物实验已经证明，进食被创伤弧菌（ Vibriovulnificus,Vv ）污染的食物或者皮肤破损接触 Vv

5、均可引起Vv感染,主要表现为严重的蜂窝组织炎和败血症13 。一旦出现败血症， 其死亡率高达50%以上46 。因其病情凶险，故对创伤弧菌感染的 临床早期快速诊断尤为重要。目前,Vv的致病机制尚未明了。但有研 究表明该菌分泌的金属蛋白酶（VVP）具有增加血管通透性，引起出 血性损伤的作用，已被证实是创伤弧菌的主要毒力因素之一 79 ,并且vvp基因在不同创伤弧菌菌株之间具有咼度保守性。 故金属蛋白 酶可作为创伤弧菌感染重要的临床实验室检测靶标。 而要制备以VVP为靶标的Vv免疫检测试剂盒，首先必须获得作为足量高纯度的 VVP 抗原来制备抗体。但是金属蛋白酶作为创伤弧菌种特征性的外毒素， 其自然分泌

6、产量并不高，且由于方法学的限制，采用常规生化方法获得 足量高纯度溶细胞素相当困难。而通过基因工程的方法，我们可以在 一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有价值的蛋白质， 对其应用或进行功能的研究。但是外源基因在工程菌中的诱导表达受 很多因素的影响，例如，诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度及摇菌的 转数等。因此，如何得到一种最佳的诱导条件组合，从而使蛋白高效 稳定的表达是我们研究的基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株和质粒原核表达载体pET-32a-vvp由本课题组构建；宿主菌 E.coliBL21/DE3由南方医科大学公共卫生与热带医学学院吴昆博士 惠赠。1.1.2诱导剂IPTG和

7、筛选用氨苄青霉素购自鼎国生物制品有限公司。1.2方法1.2.1实验设计针对诱导过程中对菌体表达蛋白产生影响的 4个因素诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度以及诱导时摇菌的转数 ，运用SPSS 11.5 统计学软件进行正交实验设计。因素及水平见表1。表1因素水平表（略）1.2.2诱导质粒pET-32a-vvp转化E.coliBL21/DE3后，挑取单菌落接种于含氨卞青霉素（100mg/L）的LB培养基中,37C活化过夜，次日按1:100 的比例转接,37 C培养至0D600约0.8时即根据不同诱导条件进行诱 导，诱导条件见实验设计。离心收集菌体，做SDS-PAGE分析,考马斯 亮蓝染色、脱色后观察。扫

8、描后运用图像分析软件 Quantity One得出各不同诱导条件下融合蛋白 VVP的表达浓度。1.2.3正交试验直观分析法分别计算每个因素各水平下的平均收率，用各因素各个水平平 均收率的极差 R（极差=平均收率的最大值-平均收率的最小值）来反 映各因素的水平变动时对试验结果影响的大小10 。1.2.4方差分析运用SPSS 11.5统计学软件对正交设计资料进行分析125结果验证在由上述方法得出的最佳诱导条件下，对转化了质粒 pET-32a-vvp 的 E.coliBL21/DE3 进行 诱导，并对结 果进行 SDS-PAGE分析，以验证此组合的诱导条件的诱导表达效果。并设 置转化空载体组及未诱导

9、组进行对照。2结果2.1 SDS-PAGE 结果取16组经不同诱导条件诱导的菌液作组间平行 SDS-PAGE,经Quantity One对染色凝胶做图像分析，来确定融合蛋白VVP表达的相 对比例。SDS-PAGE结果见图1，图上方的数字代表组别。经扫描 得到各组VVP的表达比例见表2。2.2优化结果2.2.1正交试验直观分析法运用正交试验直观分析法得出的条件优化结果见表 2和图2，K1、K2、K3、K4分别表示每个因素各水平下的蛋白表达量的均值:10。由极值R的大小推知，各因素的重要性依次为诱导摇菌转数、 诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。本实验的最佳搭配诱导条 件为摇菌转数250r/m

10、、诱导时间4h、诱导温度37 C、诱导剂IPTG 浓度1mmol/L。表2实验设计与结果分析（略）2.2.2方差分析运用SPSS 11.5统计学软件对进行正交设计资料进行方差分 析得出的条件优化结果见表3。摇菌转数的P值小于0.05,即该因素 对试实验结果影响显著；而时间、温度及 IPTG浓度的P值均大于 0.05。表3方差分析表（略）222结果的验证在诱导条件为摇菌转数250r/m、诱导时间4h、诱导温度37 C、 诱导剂IPTG浓度1mmol/L的情况下，VVP的表达量达到了 40.67%。 而其它4组对照组均无表达，见图3。3讨论正交试验设计是一种安排多因素多水平试验，并利用普通的统计分

11、 析方法来分析试验结果的一种试验设计方法10 。对于多因素多水 平的问题,通常都希望通过试验找出因素的主次关系和最优搭配条 件。用正交设计合理地安排试验，可以做到省时、省力、省钱，同时又 能得到基本满意的试验效果10。因此在本研究中，我们运用这种 实验设计方法对融合蛋白 VVP在工程菌中的诱导表达条件进行优化，旨在获得稳定高效表达的VVP蛋白，从而为VVP的致病机理研 究以及Vv免疫检测试剂盒制备奠定基础。目的基因在大肠杆菌中的诱导培养方式主要有两种， 即化学物质诱导和温度诱导，pET32a载体带有启动子T7lac，可采用化学物质IPTG 进行化学诱导11 。要实现蛋白产物的高表达，需要考虑重

12、组菌生 长和产物表达的最适环境条件，包括诱导时间、诱导温度、摇菌的转 数及最适诱导剂浓度等。细菌在诱导后，大量能量会消耗在外源蛋白 的表达上，使细菌的生长提前进入衰亡期，过度诱导会造成溶菌。因 此需要对诱导时间进行控制，找到能使外源蛋白充分表达而又不会导致溶菌的适当诱导时间，我们在实验中设计了 3个连续的时间水平1h、2h、3h。在诱导温度上，不同的蛋白对温度有不同的要求。有 研究表明，有些外源蛋白在低温下才能大量表达12 ;而本实验中 的工程菌大肠杆菌的最适生长温度是 37 C。考虑到这两方面的要求， 我们在实验中设计了 3个温度水平：20 C、30 C、37 C。摇菌的转 数对细菌的生长也

13、是极为重要的。体系溶解氧是影响菌体代谢的重要 参数,外源基因在高效转录和翻译时需要大量能量，及时给予饱和需氧 量对高效表达有意义13。加入诱导剂后通过改变搅拌转数（r/min） 来改变氧传递推动力和液相体积氧传递系数，以达到调节体系溶解氧 的目的。通常搅拌转数愈大液相体积氧传递系数愈大 ，但当r/min很大时，体系产生不可避免的泡沫而阻止了氧的传递；同时r/min过大则 产生较大的剪切力，亦对菌体生长不利11。我们在实验中设计了 3 个r/min水平：100、180、250。诱导剂IPTG的浓度对外源蛋白的 表达水平有较大影响，浓度过高会对宿主菌造成损害，过低则影响诱 导剂的效用。因此实验中设

14、计了 4个浓度水平：0.1mmom/L、0.5mmom/L、1mmom/L、2mmom/L。本实验设计的因素水平不等，因此在对正交设计资料进行直观分析 时，我们运用平均蛋白表达量 K1、K2、K3值的大小来反映各因素的不同水平对实验结果（蛋白表达量）影响的大小，并以此确定实验的 最佳搭配。用各因素各个水平蛋白平均表达量的极差 R来反映各因素的水平变动时对实验结果影响的大小。 极差大的就表示该因素的水 平变动时对实验结果的影响大，极差小的就表示该因素的水平变动时对实验结果的影响小。本实验中，我们得到因素的主次顺序为诱导摇 菌转数、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度。主要因素应取较 好的水平，

15、而次要因素，则可根据对成本、时间、收益等方面的统筹 考虑而选取适当的水平。正交试验的直观分析法简便、直观、计算量 小，但不能估计试验误差，即不能区分是由于各因素的水平变化而导 致试验结果的差异，还是由于试验的随机波动而导致试验结果的差 异。为解决此问题，可对试验结果做方差分析。由表 3可知，摇菌转数的P值小于0.05，而时间、温度及IPTG浓度的P值均大于0.05。 按方差分析法的观点，只须对有显著意义的因素确定好水平 ，而其它对试验结果没有什么影响的因素 ，则可按实际需要来确定适当的水平。方差分析的结果与直观分析方法得到的结果相同。 并且这一结果也通过VVP的高表达（表达浓度达到了 40.6

16、7 %）得到了验证。由此得 本研究的试验最佳组合为摇菌转数 250rpm、诱导时间4h、诱导温度 37 C、诱导剂 IPTG 浓度 1mmol/L。【参考文献】1 Lee CT,Amaro C,Sanjuan E,et al. Identification of DNA sequences specific for Vibrio vulnificus biotype 2 strains by suppressi on subtractive hybridizati on. Appl En vir on Microbiol, 2005，71（9）:55935597.2 Bisharat N,Ag

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