黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌16SrDNA及系统发育分析文档格式.docx

1、ResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences, Shanghai 200090）Abstract: One bacteria strain named GM2402 was isolated from the heart of natural diseased yellow cartfish （Pelteobagrus fulvidraco）, the strain was identified according to its morphological characteristics, physiology and biochemist

2、ry experiments, as well as, PCR amplification of 16S rDNA genes and sequence analysis. The results showed that strain GM2402 was Gram-negative bacterium, the ability to movement and MR-VP, salicylic acid, catalase and urease were positive, but L-rhamnose, Galactose, H2S and citrate salt were negativ

3、e. 16S rDNA sequence of strain GM2402 was 1417bp and accession number was JX101598. Strain GM2402 shared 99.6% identity with Yersinia enterocolitica strains in GenBank database. Phylogenetic tree demonstrated that strain GM2402 was gathered into one cluster with Y. enterocolitica. Both biochemical c

4、haracter and molecular analysis were proved that strain GM2402 was Y. enterocolitica. It will benefit the identification of Y. enterocolitica in aquatic animals.Keywords: Pelteobagrus fulvidraco; Yersinia enterocolitica; 16S rDNA; phylogenetic analysis黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）又名黄腊丁，属鲶形目，鲿科黄颡鱼属，广泛

5、分布在我国各种水域中，是重要的淡水经济鱼类。黄颡鱼具肉质细嫩、肌间无刺、营养价值高等优点，在保健方面还有益脾肾、利尿消肿的药理作用，使其不仅深受消费者青睐，也引起了科技人员的极大关注。近年来，国内外已有一部分学者对黄颡鱼开展了一系列研究，刘汉勤（2007）和马旭洲（2006）等对黄颡鱼的生长发育进行了探讨，吴旋（2011）研究了灵芝、黄芪多糖对黄颡鱼免疫细胞活性的影响，宋平（2001）与赵文学（2006）运用RAPD标记对黄颡鱼进行了分子鉴定及遗传多样性的分析。目前，受养殖方式的集约化、水环境恶化等多因素的影响，使得黄颡鱼在养殖过程中面临的各种疾病问题日益凸显，邓先余（2008）与周冬仁（20

6、10）等分别从患病黄颡鱼体内分离得到迟钝爱德华氏菌，黄钧（2012）从患体表溃疡病的鱼体中分离出了嗜水气单胞菌与温和气单胞菌，但尚未见到黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌的相关报道。本试验从自然发病黄颡鱼体中分离到菌株GM2402，在细胞形态学基础上，采用16S rDNA序列及系统发育分析等方法对分离菌进行了鉴定，以期望为黄颡鱼细菌性病原的分子鉴定积累科学资料。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物发病黄颡鱼于2012 年3 月采自成都市某养殖场，体长11.5cm，体重16.7g。患病症状主要表现为头部及背、腹部局部皮肤溃烂，眼睛暗淡无光，下颚、腹鳍基部等充血，肛门轻微红肿并伴有少量淡黄色液体

7、流出。1.1.2 主要试剂及仪器营养琼脂培养基（Nutrient Agar，北京奥博星生物技术有限责任公司），蛋白胨（TRYPTONE OXOID.），牛肉膏粉（Beef Extract Powder），琼脂（Agar），生化鉴定用品等均购于杭州微生物试剂有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技有限公司）。PCR仪（Eppendorf Germany），电泳仪（BIORAD），凝胶成像系统（BioRAD Laboratories Segrate Italy）。1.2 方法 1.2.1 细菌分离与纯化无菌操作取黄颡鱼心脏组织，一部分剪碎

8、后存放于LB肉汤培养基中，一部分划线接种到营养琼脂培养基上，28培养18h，选取形态均一的优势菌群，挑选单个菌落进行划线纯化。观察、记录菌落形态特征，置4保存备用。1.2.2 生理生化鉴定将纯化细菌穿刺接种于生化特性鉴定管中，进行动力性、H2S、枸椽酸盐、过氧化氢酶、七叶苷、乳糖、D-木糖、L-鼠李糖等理化测定试验。结果参考伯杰氏系统细菌鉴定手册（Brenner et al，2005），对该菌株进行初步鉴定。1.2.3 16S rDNA基因的PCR扩增模板DNA的制备：将细菌接种到LB液体培养基中，28振荡培养14h，离心收集菌体，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。细菌16

9、S rDNA扩增的通用引物：正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG -3，反向引物5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增及测序：在50ul反应体系中含有：模板4ul，上引物、下引物各2ul（引物浓度均为10mol/L）， Mix 25ul，ddH2O 17ul。PCR反应程序：94预变性4min；94 变性30s、复性60 30s、72 延伸4min，5个循环；转94 3变性0s、55 复性30s、72延伸 4min，5个循环；最后94 变性30s、50复性 30s、72延伸 4min，30个循环。PCR产物用1%琼脂

10、糖凝胶电泳检测并将阳性样品送交上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。1.2.4系统发育树的构建及分析利用Blastn系统对分离菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中相关亲近物种进行同源性检索，找出相似性最高的菌株及同属菌株作建树内群，另选取肺炎克雷伯杆（K.pneumoniae）作建树外群。采用DNAStar软件中的MegAlign程序分析分离菌株与耶尔森氏属其他细菌的同源性，再运用 ClustalX2.0软件进行多序列比对（王禄山，2008），结合MEGA5.0软件包中Neighbour-Joining法构建系统进化树，采用 Kimura-2-parameter作为校正模型估计遗传距

11、离，用Bootstap法进行置信度检测，重复抽样1000次。2结果与分析2.1细菌分离分离所得菌株在营养琼脂培养基上28 恒温培养18h后，菌落呈现为圆形，直径1.0 3.2mm，乳白色向上隆起，边缘整齐，表面光滑湿润。经革兰氏染色后发现，菌株为革兰氏阴性短杆菌，多单个散在分布或排列成堆。2.2 生理生化鉴定菌株GM2402主要生理生化试验结果见表1，即表现为具动力性，V-P试验阳性、-半乳糖苷酶、过氧化氢酶阳性，不利用枸椽酸盐，不分解蔗糖、葡萄糖，不发酵鼠李糖、棉籽糖、肌醇、七叶苷，还原硝酸盐为亚硝酸盐，产H2S。结果参照伯杰氏系统细菌鉴定手册基本符合小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化特性。表1 菌

12、株GM2402的生化鉴定结果Table 1 Results of biochemical experiment of strain GM2402鉴定项目Items小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株GM2402动力（Motility）+硫化氢（H2S production）-硝酸盐还原酶（Nitrate reductase）葡磷胨水（MR.VP）-半乳糖苷酶（-Galactosidase）葡萄糖（Glucose）蔗糖（Sucrose）棉籽糖（Raffinose）鼠李糖（Rhamnose）过氧化氢酶（Catalase）水杨酸（salicylic acid） -+ 七叶苷（Aesculin hydrolysi

13、s）d肌醇（Inositol）枸椽酸盐（Citrate）侧金盏花醇（Adonitol）Note: “+” Positive; “-” Negative; “-” 1125%Positive; “d” difference between strains2.3 16S rDNA扩增及分析以菌株GM2402总DNA为模板，采用16S rDNA通用引物对其进行体外扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，最终扩增出长度大小约为1500bp的PCR产物，结果见图1。根据测序结果16S rDNA序列实长1417bp，将此序列提交至GenBank，登录号为JX101598。同源性比对分析表明菌株GM2402与多

14、株小肠结肠炎耶尔森氏菌（Y. enterocolitica）的相似性高达99.6%，详见表2。 图1 分离菌株16S rDNA基因的PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of 16S rDNA genes for the isolated bacteriaNote: M: DNA marker; 1、2: PCRproductsof 16SrDNAinstrainGM2402表2 菌株GM2402与其他菌株的同源性分析结果Table 2Homology analysis of strain GM2402 and the representative strains 2.4系统

15、发育树和遗传距离系统发育树结果见图2，菌株GM2402（图中用“”标注）与耶尔森氏菌属聚为一个类群，与小肠结肠炎耶尔森氏菌（Z49828）同源性最高，聚为一个分支，明显与肺炎克雷伯杆菌（K.pneumonia）分开。用于本次比较的多株耶尔森氏菌其遗传距离变化范围在0.0010.026之间，菌株GM2402与小肠结肠炎耶尔森氏菌（Y. enterocolitica）的遗传距离变化在00.002之间，与鼠疫耶尔森氏菌（Y.pestis）的遗传距离变化在0.0010.022之间，与假结核耶尔森氏菌（Y. pseudotuberculosis）和鲁氏耶尔森氏菌（Y. ruckeri）的遗传距离分别在0

16、0.22与0.0150.026之间，遗传距离的结果详见表3。通过上述分析，可以确定菌株GM2402为小肠结肠炎耶尔森氏菌（Y. enterocolitica）。表3 基于Kim-ura 2-parameter 模型计算的遗传距离Table 3 The pairwise divergence based on Kim-ura 2-parameter图2菌株GM2402 16S rDNA系统发育进化树 Fig.2 Phylogenetic tree generated from an alignment of 16S rDNA numbers beside branches in tree are

17、 bootstrap values, “” represent the accession numbers of strains in GenBank3 讨论小肠结肠炎耶尔森氏菌广泛分布于自然界中，经常从人类、家畜、家禽、鸟类、水、土壤、昆虫及各种食品中检出（郑浩轩，2006），易引起人类急性肠道腹泻等胃肠道疾病，于20世纪80年代被确立为耶尔森氏属中最重要的食源性致病菌，所致疾病呈世界性分布，因此多个国家已将该菌列为进出口食物常规检查项目。而耶尔森属的鲁氏耶尔森氏菌（Y. ruckeri）是公认的鱼类致病菌，已在冷水性鲑鳟鱼（Salmonids）中有大量（Fernandez et al，20

18、03；Wortberg et al,2012）报道，范方玲等（2010）在发病斑点叉尾鮰中也检测到鲁氏耶尔森氏菌，但小肠结肠炎耶尔森氏菌致水产动物疾病的报道较少，仅周燕侠（2009）在拟鲿鱼中发现一例。传统的小肠结肠炎耶尔森氏菌分离、鉴定主要运用选择性增菌培养、生化鉴定与血清分型等方法。张昕等（2008）在研究小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测中发现CIN-1琼脂培养基对该菌选择性优于改良磷酸盐缓冲液（PBS）、尿素酶琼脂、改良克氏双糖培养，与改良Y同时使用时可提高检出率，孙勇等（2007）观察到在CIN-1培养基上小肠结肠炎耶尔森氏菌表现为直径较小、具有深红中心、绕有透明无色圆环边缘清晰的特征性菌落

19、，在改良Y上呈现粉红色菌落。本次采用了生理生化试验对菌株GM2402进行了鉴定，鉴定结果虽与鉴定手册上小肠结肠炎耶尔森氏菌模式菌株的性状相似，但也存在一定差异，这提示菌株与菌株间会存在一些差异，而且不同地区、不同时间及不同物种来源的菌株间也将会有不同程度的变异，同时该结果与耶尔森属的其他菌种间差异不明显（Brenner et al，2005）。另外，该方法还存在耗时长、费力多、灵敏度低等问题，所以不能十分准确判定其分类地位。随着现代分子生物学的迅速发展，各种分子鉴定技术在小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离鉴定中得到了较广泛地应用。郑浩轩等（2006）针对产耐热肠毒素（yst）致病基因设计了特异引物和探

20、针进行实时定量PCR从腹泻粪便中检测出小肠结肠炎耶尔森菌。Quinn（2012）使用变性梯度凝胶电泳技术从鲑鱼皮肤粘液中分离到了耶尔森氏菌。Janse等（2012）通过对比实时荧光定量PCR用悬浮芯片法快速、准确的从环境中鉴定出了耶尔森氏菌，此外还有胶体金标记免疫层析条（唐浏英，2006）、环介导等温扩增技术（徐德顺，2011）等，这些方法各有优劣，本实验从黄颡鱼体内分离到一株细菌，采用细菌鉴定“金标准”的16S rDNA序列对菌株GM2402进行了分子鉴定。Woese（1977）曾指出16SrRNA序普遍存在于原核生物中，其功能同源，既含保守序列又存在可变区域，分子大小也适合操作，最重要的是

21、其分子序列变化的速度与进化距离相适应，利用其序列之间的比较差异，即可绘制出生命进化树。16S rDNA序列分析观点经众多科研工作者及大量实验所证实（邓国成，2009；Ebani VV et al，2012 ），目前已被公认为是最适合于细菌的系统发育和分类鉴定。利用该方法对水产动物病原菌进行鉴定，不仅节约了时间，而且大大提高了准确度。本实验对菌株GM2402的16SrDNA基因进行了PCR扩增、同源性比对、遗传距离及系统进化树分析，结果判定该菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌，从而验证了16SrDNA分析方法在细菌鉴定中的准确性。虽然如此，16SrDNA鉴定方法也存在一定的不足，例如：要求所分析的序列与

22、同属内的相似性不低于97%，同时数据库中收录的少数序列并未经过严格筛选，可能存在一定误差，因此，分离鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌应同时选用多种方法相互补充、相互印证，如采用选择性培养基、生理生化及16SrDNA分析等，才能够快速获得准确的鉴定结果。综上所述，本研究从黄颡鱼体中分离到一株细菌，经生理生化鉴定试验、体外扩增16S rDNA序列及构建系统发育树等方法，快速准确地鉴定了该菌株为小肠结肠炎耶尔森氏菌。为下一步深入研究该菌在致病性、耐药性及免疫等方面研究奠定了坚实的基础。参考文献:刘汉勤,崔书勤,侯昌春,等.2007. 从XY雌鱼雌核发育产生YY超雄黄颡鱼J. 水生生物学报, 11（5）: 7

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