浅论siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响文档格式.docx

1、 细胞增殖； 凋亡 研究表明，人乳头瘤病毒（HPV） 16型E6 基因在宫颈癌的发生发展及恶性表型的维持中起着至关重要的作用，因此它已成为宫颈癌基因治疗的理想靶点之一。RNA干扰（RNAi）技术是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法1 2 。已有研究证实，化学合成的小干扰RNA （siRNA） 能有效地抑制目的基因的表达，但作用持续时间短，而siRNA表达载体的方法可能延长作用持续时间3。本研究拟通过载体介导的RNAi技术来封闭宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，观察HPV16 E6 siRNA表达载体对Caski细胞增殖的影响。 1 材料和方法 细胞转染 Caski细胞为HPV16阳性的

2、宫颈癌细胞株，购自武汉大学典型物培养保藏中心。在研究中用脂质体法将HPV16 E6特异性siRNA表达载体E6 2（由第一作者所在实验室设计构建保存）4和空载体P0转染Caski细胞，通过G418（1 500 gml-1）抗性筛选，至空白对照细胞完全死亡后，降低G418为750 gml-1，转染后14 d得到抗性克隆细胞，分别命名为Caski E6 2、Caski P0。收集抗性克隆形成后1周的细胞。荧光定量RT PCR检测HPV16 E6 mRNA的表达 细胞总RNA的提取及逆转录 操作参照试剂盒TrizolTMRNA Isolation Reagent（GIBCO）和RevertA idT

3、M First Strand cDNA synthesis Kit（MBI）说明书进行。荧光定量RT PCR扩增 实验设Caski组、Caski P0组、Caski E6 2组3组，每项检测重复3次，取平均值。为避免收集细胞和实验过程中RNA的降解、所收集细胞数量的差异以及实验过程中操作带来的误差，计算时用细胞中表达恒定的看家基因GAPDH（3 磷酸甘油醛脱氢酶）逆转录扩增产物量的CT值来校正HPV16 E6 mRNA表达变化。HPV16 E6上游引物为5 GAATGTGTGTACT GCAAGCA 3，下游引物为5 CACAGTGGCTTTTGACA GTT 3，TAQman探针为5 CAG

4、CATATGGATTCCCATC TC 3。GAPDH上游引物为5 TGGGTGTGAACCACG AGAA 3，下游引物为5 GGCAT GGACTGTGGTCAT GA 3，探针为5 CTGCACCACCAACTGCTTAGC 3。其中探针于5端标记荧光发光基团FAM，3端标记荧光淬灭基团TAMRA（引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。在荧光定量PCR仪上进行PCR，扩增条件如下: 94 1 min；94 10 s，55 30 s，72 1 min，45个循环；55 30 s。从PCR动力学曲线读取荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数CT值。荧光定量RT PCR结果计算 参照

5、文献5报道的比较阈值法。从各样品荧光定量PCR动力学曲线中判读其Ct值，用处理组样本基因的Ct值减去处理组参照基因的Ct值，得到Ct1，同样，用对照组样本基因的Ct值减去对照组参照基因的Ct值，得到Ct2，再用Ct1减去Ct2，得到Ct，即CtCt1-Ct2。处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式：处理组样本基因/对照组样本基因=EX-Ct 。抑制率=100。流式细胞仪检测HPV16 E6蛋白的表达 流式细胞仪由四川大学人类疾病生物治疗实验室提供。流式细胞术检测阴性对照组、Caski组、Caski P0组、Caski E6 2组4组细胞中HPV16 E6蛋白的表达，每项检测重复3次，取

6、平均值。蛋白抑制率公式：1-/细胞凋亡测定 胰酶消化培养好的细胞，得到细胞沉淀，置于1 ml eppendorf管中，PBS缓冲液重悬细胞，1 000 rmin-1离心5 min得到细胞沉淀。再次重复洗涤沉淀过程，加入75%乙醇重悬细胞并固定30 min以上，送流式细胞仪进行细胞凋亡率的检测。生长曲线的测定 分别取对数生长期的Caski、Caski P0、Caski E6 2细胞,消化后用含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液制成单细胞悬液,调整浓度为105ml-1，以50 l孔-1接种于96孔培养板，每组设3个复孔，同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔，放入37 、5% CO2 孵箱培

7、养；于培养1、2、3、4、5 d 后，每孔加入MTT溶液（5 mgml-1） 20 l，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 l DMSO振荡，并于酶联免疫检测仪490 nm 波长下测定各孔光吸收（A）值。以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。细胞克隆形成率的测定 取对数生长期细胞胰酶消化成单细胞悬液，以每孔200个细胞分别接种于6孔板中，每孔设4个复孔，于37 、5CO2饱和湿度环境下静止培养2周。终止培养，弃去培养液，PBS（ mmol，pH ）洗涤2次，纯甲醇固定15 min，姬姆萨染色20 min，流水洗去染色液，空气干燥。显微镜下计数克隆数。将细胞数大于5

8、0个细胞团作为克隆计数，取平均克隆数计算克隆形成率。克隆形成率（）=平均克隆数/每孔加入的单细胞数统计学处理 实验结果以x-s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，多组的两两比较用SNK法。2 结 果HPV16 E6 mRNA表达的变化 根据标准曲线计算扩增效率EX=，即CT值减少1个循环对应模板DNA增加倍。由表1可见，Caski E6 2组细胞E6 mRNA表达较Caski组明显降低（P），抑制率为%。而Caski P0组细胞与Caski组相比，E6 mRNA的表达差异无统计学意义。表1 HPV16 E6和内对照GAPDH mRNA的 Ct值、Ct值及抑制率与Caski组

9、比较，1）P,2）P HPV16 E6 蛋白表达的变化 由表2可见，Caski细胞E6蛋白表达较Caski组降低（P），抑制率为%。而Caski P0细胞与Caski组相比，E6蛋白的表达差异无统计学意义。转染RNA干扰表达载体后Caski细胞凋亡情况的变化 转染 Caski E6 2、 Caski P0质粒的阳性克隆株及Caski细胞的凋亡峰值见图1。 Caski E6 2、Caski P0及Caski组细胞的凋亡率依次为%、及，可见转染RNAi表达质粒表2 HPV16 E6蛋白荧光表达强度值及抑制率 的细胞凋亡率明显高于Caski P0及Caski组。MTT 法检测细胞生长曲线的变化 转染

10、质粒E6 2、空质粒P0的Caski细胞阳性克隆及Caski细胞第15天的MTT A值及细胞生长曲线见表3和图2。表3 各组细胞不同时间点的A值 可见转染RNA干扰表达载体E6 2的细胞生长速度较Caski组细胞明显减慢。而Caski P0组与转染前相比，细胞增殖无明显变化。Caski P0 和Caski 细胞的生长速率相近，而Caski E6 2细胞生长速度明显减慢,表明E6 siRNA 表达载体E6 2的导入影响了Caski细胞的生长。细胞克隆形成率 统计学分析显示，Caski E6 2组的克隆形成数与Caski组及Caski P0组比较差异有显着性，Caski P0细胞的克隆形成数与Ca

11、ski细胞比较差异无显着性。见表4。表4 各组细胞的克隆计数及克隆形成率 与Caski组比较，1）P,2）P 3 讨 论 siRNA目前主要是通过体外直接化学合成，但化学合成的siRNA引起的基因沉默效应存在着作用时间短而且耗费大等缺点。本研究使用的pSilencer H1载体含H1启动子，可在绝大多数哺乳动物细胞内自主合成小分子RNA，被广泛应用于反义RNA技术。载体包含有RNA聚合酶（Pol）启动子（Hl prom）和1个有5个T的转录终止位点，1个保守的A开始转录合成RNA。遇到5个连续的U即终止，转录产物在转录终止位点的第2个碱基处终止，非常精确。只要将编码一小段对应目的基因特异序列的

12、、其RNA能形成发夹结构的RNA序列插入载体中Pol 启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出短发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA），这种RNA很快在细胞中加工成为大约21个碱基大小的双链RNA分子，随后启始RNA干扰过程6 。该质粒带有可表达抗氨基糖苷类抗生素G418蛋白氨基糖磷酸转移酶的Neo基因，通过G418筛选,得到能长时间稳定表达发夹状RNA的阳性克隆细胞。 本研究利用前期构建成功的HPV16 E6特异性siRNA表达载体来转染Caski细胞，观察它对E6基因的抑制作用。结果发现：在抗性克隆形成后1周，即转染后3周，E6 siRNA表达载体能使Cask

13、i 细胞E6 mRNA和蛋白的表达被明显抑制，抑制率分别为和，而空载体对二者的表达皆无明显影响，说明HPV16 E6 siRNA表达载体能特异高效地抑制Caski细胞E6基因的表达；而且siRNA表达载体的作用持续时间明显超过了化学合成siRNA的作用时间，说明HPV16 E6 siRNA表达载体能较长期地抑制Caski细胞E6基因的表达。 转染E6 2、P0质粒的阳性克隆及Caski组细胞的凋亡率分别为%、，可见我们构建的HPV16 E6 RNAi表达载体转染细胞后明显增加了细胞的凋亡率，而空质粒P0组的凋亡率并未增加，排除了质粒本身及G418筛选可能造成的影响，说明质粒是通过抑制E6基因的

14、表达促进细胞凋亡的。 E6蛋白致癌的关键是由于它与p53结合,导致p53降解,从而使p53对细胞增殖周期相关因子 p21（WAF1）、增殖细胞核抗原等的调节作用丧失，细胞中DNA损伤累积造成细胞癌变。抑制E6的表达可使肿瘤细胞的p53反应蛋白表达上调，激活caspase 9和caspase 3，抑制细胞的增殖7 8。细胞生长曲线显示，E6 2表达载体明显抑制了肿瘤细胞的生长，Caski E6 2细胞在软琼脂上形成克隆能力也明显低于Caski P0和Caski细胞，提示我们构建的RNA干扰表达载体明显抑制了肿瘤细胞的增生和克隆的形成。而空质粒载体转染的Caski P0组细胞生长速率和克隆形成率与

15、Caski组细胞比较无明显变化，排除了质粒本身及G418对细胞的影响。 综上所述，HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，有效抑制肿瘤细胞的增殖，这为HPV相关宫颈癌的基因治疗提供了理论依据。【参考文献】 1EFFNER M,WERNESS B A,HUIBREGTSE J M,etE6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53J.Cell,1990，63（6）:1129 1136.

16、2BAK RNA interferencean efficient way for silenceJ.J Postepy Biochem,2003,49（3）:136 146.3CAPLEN N J,PARRISH S,IMANI F,etinhibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrates and vertebrate systemsJ.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:9746 9747.4李大可,彭芝兰,牛晓宇,等.RNAi表达载体对宫颈癌HPV16 E6基因表

17、达的抑制作用J.四川大学学报:医学版,2005,36（3）:331 333.5LIVAK K J,SCHMITTGEN Tof relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2 （ Delta Delta C（T） methodJ.Methods,2001,25（4）:402 408.6PADDISON P J,CAUDY A A,BERNSTEIN E,ethairpin RNAs （shRNAs） induce sequence specific silencing in mammalian cellsJ.Genes Dev,2002,16（8）:948 958.7DOORBARbiology of human papillomavirus infection and cervical cancerJ.Clin Sci（Lond）,2006,110（5）:525 541.8NARISAWA SAITO M,KIYONOmechanisms of high risk human papillomavirus induced carcinogenesis: roles of E6 and E7 proteinsJ.Cancer Sci,2007,98（10）: 1505 1511.