浅论siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响文档格式.docx

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细胞增殖；

凋亡

研究表明，人乳头瘤病毒（HPV）16型E6基因在宫颈癌的发生发展及恶性表型的维持中起着至关重要的作用，因此它已成为宫颈癌基因治疗的理想靶点之一。

RNA干扰（RNAi）技术是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法［12］。

已有研究证实，化学合成的小干扰RNA（siRNA）能有效地抑制目的基因的表达，但作用持续时间短，而siRNA表达载体的方法可能延长作用持续时间［3］。

本研究拟通过载体介导的RNAi技术来封闭宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，观察HPV16E6siRNA表达载体对Caski细胞增殖的影响。

1材料和方法

　细胞转染

Caski细胞为HPV16阳性的宫颈癌细胞株，购自武汉大学典型物培养保藏中心。

在研究中用脂质体法将HPV16E6特异性siRNA表达载体E62（由第一作者所在实验室设计构建保存）［4］和空载体P0转染Caski细胞，通过G418（1500μg·

ml-1）抗性筛选，至空白对照细胞完全死亡后，降低G418为750μg·

ml-1，转染后14d得到抗性克隆细胞，分别命名为CaskiE62、CaskiP0。

收集抗性克隆形成后1周的细胞。

　荧光定量RTPCR检测HPV16E6mRNA的表达细胞总RNA的提取及逆转录操作参照试剂盒[TrizolTMRNAIsolationReagent（GIBCO）和RevertAidTMFirstStrandcDNAsynthesisKit（MBI）]说明书进行。

　荧光定量RTPCR扩增实验设Caski组、CaskiP0组、CaskiE62组3组，每项检测重复3次，取平均值。

为避免收集细胞和实验过程中RNA的降解、所收集细胞数量的差异以及实验过程中操作带来的误差，计算时用细胞中表达恒定的看家基因GAPDH（3磷酸甘油醛脱氢酶）逆转录扩增产物量的CT值来校正HPV16E6mRNA表达变化。

HPV16E6上游引物为5′GAATGTGTGTACT

GCAAGCA3′，下游引物为5′CACAGTGGCTTTTGACA

GTT3′，TAQman探针为5′CAGCATATGGATTCCCATC

TC3′。

GAPDH上游引物为5′TGGGTGTGAACCACG

AGAA3′，下游引物为5′GGCATGGACTGTGGTCAT

GA3′，探针为5′CTGCACCACCAACTGCTTAGC3′。

其中探针于5′端标记荧光发光基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA（引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。

在荧光定量PCR仪上进行PCR，扩增条件如下:

94℃1min；

94℃10s，55℃30s，72℃1min，45个循环；

55℃30s。

从PCR动力学曲线读取荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数CT值。

　荧光定量RTPCR结果计算参照文献［5］报道的比较阈值法。

从各样品荧光定量PCR动力学曲线中判读其Ct值，用处理组样本基因的Ct值减去处理组参照基因的Ct值，得到ΔCt1，同样，用对照组样本基因的Ct值减去对照组参照基因的Ct值，得到ΔCt2，再用ΔCt1减去ΔCt2，得到ΔΔCt，即ΔΔCt＝ΔCt1-ΔCt2。

处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式：

处理组样本基因/对照组样本基因=EX-ΔΔCt。

抑制率=×

100％。

　流式细胞仪检测HPV16E6蛋白的表达

流式细胞仪由四川大学人类疾病生物治疗实验室提供。

流式细胞术检测阴性对照组、Caski组、CaskiP0组、CaskiE62组4组细胞中HPV16E6蛋白的表达，每项检测重复3次，取平均值。

蛋白抑制率公式：

［1-/］×

　细胞凋亡测定

胰酶消化培养好的细胞，得到细胞沉淀，置于1mleppendorf管中，PBS缓冲液重悬细胞，1000r·

min-1离心5min得到细胞沉淀。

再次重复洗涤沉淀过程，加入75%乙醇重悬细胞并固定30min以上，送流式细胞仪进行细胞凋亡率的检测。

　生长曲线的测定

分别取对数生长期的Caski、CaskiP0、CaskiE62细胞,消化后用含10%小牛血清的RPMI1640培养液制成单细胞悬液,调整浓度为105ml-1，以50μl·

孔-1接种于96孔培养板，每组设3个复孔，同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔，放入37℃、5%CO2孵箱培养；

于培养1、2、3、4、5d后，每孔加入MTT溶液（5mg·

ml-1）20μl，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150μlDMSO振荡，并于酶联免疫检测仪490nm波长下测定各孔光吸收（A）值。

以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

　细胞克隆形成率的测定

取对数生长期细胞胰酶消化成单细胞悬液，以每孔200个细胞分别接种于6孔板中，每孔设4个复孔，于37℃、5％CO2饱和湿度环境下静止培养2周。

终止培养，弃去培养液，PBS（mmol，pH）洗涤2次，纯甲醇固定15min，姬姆萨染色20min，流水洗去染色液，空气干燥。

显微镜下计数克隆数。

将细胞数大于50个细胞团作为克隆计数，取平均克隆数计算克隆形成率。

克隆形成率（％）=平均克隆数/每孔加入的单细胞数×

　统计学处理

实验结果以x-±

s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，多组的两两比较用SNK法。

　　2结果

　HPV16E6mRNA表达的变化

根据标准曲线计算扩增效率EX=，即CT值减少1个循环对应模板DNA增加倍。

由表1可见，CaskiE62组细胞E6mRNA表达较Caski组明显降低（P＜），抑制率为%。

而CaskiP0组细胞与Caski组相比，E6mRNA的表达差异无统计学意义。

表1HPV16E6和内对照GAPDHmRNA的Ct值、ΔΔCt值及抑制率与Caski组比较，1）P＜,2）P＞HPV16E6蛋白表达的变化

由表2可见，Caski细胞E6蛋白表达较Caski组降低（P＜），抑制率为%。

而CaskiP0细胞与Caski组相比，E6蛋白的表达差异无统计学意义。

　转染RNA干扰表达载体后Caski细胞凋亡情况的变化转染CaskiE62、CaskiP0质粒的阳性克隆株及Caski细胞的凋亡峰值见图1。

CaskiE62、CaskiP0及Caski组细胞的凋亡率依次为%、％及％，可见转染RNAi表达质粒表2HPV16E6蛋白荧光表达强度值及抑制率的细胞凋亡率明显高于CaskiP0及Caski组。

　MTT法检测细胞生长曲线的变化

转染质粒E62、空质粒P0的Caski细胞阳性克隆及Caski细胞第1～5天的MTTA值及细胞生长曲线见表3和图2。

表3各组细胞不同时间点的A值可见转染RNA干扰表达载体E62的细胞生长速度较Caski组细胞明显减慢。

而CaskiP0组与转染前相比，细胞增殖无明显变化。

CaskiP0和Caski细胞的生长速率相近，而CaskiE62细胞生长速度明显减慢,表明E6siRNA表达载体E62的导入影响了Caski细胞的生长。

　细胞克隆形成率

统计学分析显示，CaskiE62组的克隆形成数与Caski组及CaskiP0组比较差异有显着性，CaskiP0细胞的克隆形成数与Caski细胞比较差异无显着性。

见表4。

表4各组细胞的克隆计数及克隆形成率与Caski组比较，1）P＜,2）P＞

　3讨论

siRNA目前主要是通过体外直接化学合成，但化学合成的siRNA引起的基因沉默效应存在着作用时间短而且耗费大等缺点。

本研究使用的pSilencerH1载体含H1启动子，可在绝大多数哺乳动物细胞内自主合成小分子RNA，被广泛应用于反义RNA技术。

载体包含有RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子（Hlprom）和1个有5个T的转录终止位点，1个保守的A开始转录合成RNA。

遇到5个连续的U即终止，转录产物在转录终止位点的第2个碱基处终止，非常精确。

只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、其RNA能形成发夹结构的RNA序列插入载体中PolⅢ启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出短发夹状RNA（smallhairpinRNA，shRNA），这种RNA很快在细胞中加工成为大约21个碱基大小的双链RNA分子，随后启始RNA干扰过程［6］。

该质粒带有可表达抗氨基糖苷类抗生素G418蛋白——氨基糖磷酸转移酶的Neo基因，通过G418筛选,得到能长时间稳定表达发夹状RNA的阳性克隆细胞。

本研究利用前期构建成功的HPV16E6特异性siRNA表达载体来转染Caski细胞，观察它对E6基因的抑制作用。

结果发现：

在抗性克隆形成后1周，即转染后3周，E6siRNA表达载体能使Caski细胞E6mRNA和蛋白的表达被明显抑制，抑制率分别为％和％，而空载体对二者的表达皆无明显影响，说明HPV16E6siRNA表达载体能特异高效地抑制Caski细胞E6基因的表达；

而且siRNA表达载体的作用持续时间明显超过了化学合成siRNA的作用时间，说明HPV16E6siRNA表达载体能较长期地抑制Caski细胞E6基因的表达。

转染E62、P0质粒的阳性克隆及Caski组细胞的凋亡率分别为%、％、％，可见我们构建的HPV16E6RNAi表达载体转染细胞后明显增加了细胞的凋亡率，而空质粒P0组的凋亡率并未增加，排除了质粒本身及G418筛选可能造成的影响，说明质粒是通过抑制E6基因的表达促进细胞凋亡的。

E6蛋白致癌的关键是由于它与p53结合,导致p53降解,从而使p53对细胞增殖周期相关因子p21（WAF1）、增殖细胞核抗原等的调节作用丧失，细胞中DNA损伤累积造成细胞癌变。

抑制E6的表达可使肿瘤细胞的p53反应蛋白表达上调，激活caspase9和caspase3，抑制细胞的增殖［78］。

细胞生长曲线显示，E62表达载体明显抑制了肿瘤细胞的生长，CaskiE62细胞在软琼脂上形成克隆能力也明显低于CaskiP0和Caski细胞，提示我们构建的RNA干扰表达载体明显抑制了肿瘤细胞的增生和克隆的形成。

而空质粒载体转染的CaskiP0组细胞生长速率和克隆形成率与Caski组细胞比较无明显变化，排除了质粒本身及G418对细胞的影响。

综上所述，HPV16E6siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，有效抑制肿瘤细胞的增殖，这为HPV相关宫颈癌的基因治疗提供了理论依据。

【参考文献】

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［4］李大可,彭芝兰,牛晓宇,等.RNAi表达载体对宫颈癌HPV16E6基因表达的抑制作用［J］.四川大学学报:

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［8］NARISAWASAITOM,KIYONO　mechanismsofhighriskhumanpapillomavirusinducedcarcinogenesis:

rolesofE6andE7proteins［J］.CancerSci,2007,98（10）:

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