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1、HE染色protocolHE染色protocol常规HE染色石蜡包埋的组织切片必须经过脱蜡水洗处理才能染色，让水溶性染料渗入组织中，含蜡的组织切片无法进行任何染色。所以，在染色前必须用二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，经过乙醇洗后，再用水洗。即石蜡组织切片二甲苯乙醇（无水乙醇，95%，80%）水。人们通常把这个过程叫做切片脱蜡至水。脱蜡至水是染色前的必须完成的基本步骤。一般脱蜡至水的时间和步骤如下：HE染色脱蜡至水步骤步骤顺序试剂时间1二甲苯脱蜡5 min2二甲苯脱蜡5 min3二甲苯脱蜡5 min 4无水乙醇浸洗1 min595%乙醇浸洗1 min695%乙醇浸洗1 min780%乙醇浸洗1 mi

2、n8自来水冲洗3-5 min冰冻切片和细胞涂片样品的染色不需要经过脱蜡至水步骤，水洗后直接用苏木精和伊红染色。染色是利用染料的不同作用，使组织与染料以不同方式进行结合。常规染色是苏木精和伊红染色（H.E）。特殊染色（special stains）和组织化学（免役组织化学）染色是根据诊断的需要对组织中的某些成分进行非常规的染色。HE染色用的苏木精是一种树木苏木的一种氧化产品，因为这种树非常罕见，多数氧化苏木精是合成品。苏木精必须氧化成熟后才能使用。苏木精染液需要预先配制，放置几个月自然氧化成熟。或购买成熟过的商品苏木精，也可在苏木精液中加一些成熟剂。苏木精本身对组织没有染色作用，需要“媒染剂”与

3、组织连接，媒染剂是铁，铝，钨等由这类正离子金属提供。矾也是苏木精常用的媒染剂，如Harris苏木精的配制以硫酸铝钾（钾明矾）或铵明矾作为媒染剂。不同媒染剂配制的苏木精染色强度不同。苏木精作为一种基础染料对细胞核的核酸具有一定的亲和力。Mayer苏木精明矾液10%苏木精乙醇掖10ml碘化钠0.2g钾明矾或铵矾50g水合氯醛50g枸橼酸1g蒸馏水1000ml用蒸馏水溶解固体然后加入苏木精液。伊红水溶液配制伊红水溶液伊红Y0.5g蒸馏水100ml先用少量蒸馏水溶解伊红，再用玻璃棒搅拌溶解，完全溶解后加入剩余的蒸馏水。苏木精染色后分化需要的液体盐酸乙醇液配制盐酸乙醇液75%乙醇0100ml浓盐酸0.5

4、ml苏木精染色后蓝化需要的液体目的（PURPOSE）To be used for bluing the hematoxylin stain, follows the decoloration, acid rinse, in regressive staining.蓝化液（BLUING SOLUTIONS）1Scotts TapWater/Bluing硫酸镁（MgSO4）30g碳酸氢钠2g自来水3000ml充分混合，标记 液体日期。推荐用于Gills 苏木精蓝化。20.05%碳酸锂碳酸锂0.5g蒸馏水1000ml充分混合，标记 液体日期。3氨水氢氧化铵5ml蒸馏水1000ml充分混合，标记 液体

5、日期。对事先冻存过的组织会引起脱片。水蓝化自来水流水冲洗10-30min手工H E染色方法和步骤石蜡切片必须经过脱蜡至水。 冰冻切片先经过电吹风吹干，再用冰冻固定液短时间固定，不用经过脱蜡至水直接用自来水冲洗后进行染色。染色步骤参考表染色步骤1组织切片脱蜡至水2Harris苏木精液35 min3自来水洗1 min475%盐酸乙醇液分化数秒钟5自来水流水冲洗10min至细胞核呈蓝色，也可以使用蓝化液返蓝60.5%伊红水溶液1 min795%乙醇脱水1 min895%乙醇脱水1 min9无水乙醇脱水1 min10无水乙醇脱水1 min11二甲苯透明1 min12二甲苯透明1 min13中性树胶或D

6、PX封固结果细胞核蓝色，细胞浆红色，背景粉红色。自动染色机染色方法和步骤Shandon Varislain Gemini自动染色机使用方法1.Shandon Varislain Gemini自动染色机 染色机有26个试剂槽，6个冲洗水位，5个干燥储存位，附载玻片框、水洗管、碳过滤器等。可以编制多个染色程序，根据染色机操作菜单编制常用的染色程序，所有准备工作完成后运行染色程序。2.准备常用的染液和试剂1二甲苯275%乙醇395%乙醇4无水乙醇5Mayers苏木精60.5%伊红水溶液71%盐酸乙醇3.编制常规HE染色程序HE染色程序参考表项目试剂时间脱蜡二甲苯10 min二甲苯10 min乙醇洗涤

7、无水乙醇2 min无水乙醇2 min95%乙醇1 min75%乙醇1 min流水冲洗（搅拌）1 min苏木精染色Mayer苏木精10 min流水冲洗1 min分化1%盐酸乙醇10 s流水冲洗（搅拌）20min伊红染色0.5%伊红水溶液1min流水冲洗(搅拌)1min脱水95%乙醇30 s95%乙醇30 s无水乙醇2 min无水乙醇2 min透明二甲苯2 min二甲苯2 min使用说明1并根据显示器上的提示在相应试剂槽中加入需要的染液和试剂, 每种约300ml。2石蜡切片80烤片，20分钟。将切片放入装载玻片框里置染色机中。选择染色程序。3染色机可以显示染色程序的运行情况，主要信息包括染色开始时

8、间和染色结束时间及染色运行状况等，如果染色程序出现错误，可以随时终止运行。4染色质量的控制，据中国医科大学使用情况统计，300ml苏木精染色1500-1800张；300ml伊红水溶液染色2500-2800张；300ml其他试剂约处理800-1000张。需要更换新液。以便保证染色质量。5温度低于15染色效果不佳。应该调整室温。6因为染色用的试剂多为易燃品，染色机应远离火源。7进水孔要保持通常，需要定时进行清洗。定时更换碳过滤器。8染色完成后机器会发出提示声音。9片按常规中性树胶封片。4.细胞学涂片HE染色程序细胞学涂片HE染色程序参考表项目试剂时间固定95%乙醇10 min流水冲洗（搅拌）1 m

9、in苏木精染色Mayer苏木精10 min流水冲洗1 min分化1%盐酸乙醇10 s流水冲洗（搅拌）20min伊红染色0.5%伊红水溶液1min流水冲洗(搅拌)1min脱水95%乙醇30 s95%乙醇30 s无水乙醇2 min无水乙醇2 min透明二甲苯2 min二甲苯2 min使用说明 染色完成后机器会发出提示声音。 取出切片按常规中性树胶封片。二 封片切片染色后必须先通过80%、95%和无水系列乙醇脱水，然后经过透明剂透明。透明完成后在有组织的地方加上中性树胶或DPX，然后用清洁后盖玻片覆盖在组织上。人们通常把这个过程叫做封片。从市场上购买的盖玻片一般没有经过清洗，须要清洗处理后才能使用。

10、根据组织的大小选用。盖玻片规格参考下表规格包装厚度18*18mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm20*20mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm22*22mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm24*24mm100片/合10合/包600合/箱0.13-0.17mm24*32mm100片/合10合/包400合/箱0.13-0.17mm24*50mm100片/合10合/包400合/箱0.13-0.17mm盖玻片清洗处理的方法和步骤玻璃器皿清洁液配制 用途：主要用于玻璃器皿的清洁。设备：4000ml长颈瓶，磁棒，磁力搅拌器67升盖着玻

11、璃容器（瓷罐）试剂：酸清洁液：重络酸钾400g，蒸馏水4000ml，硫酸400ml。用水溶解重络酸钾，把重络酸钾液倒入瓷罐中，慢慢加入硫酸使液体变为棕黑色，按照使用，标明开始使用日期。注意：酸。有腐蚀性，致癌剂。安全措施：戴胶手套，防护眼镜，穿工作服。把硫酸慢慢加到液体里，在通风好的地方操作。硫酸：烟雾吸入会有害，影响器官皮肤，呼吸器官，生殖系统和胎儿组织。刺激皮肤眼睛和呼吸道。使用硫酸时操作应特别注意，硫要慢慢地加入液体里。盖玻片清洗步骤1拆开盖玻片的包装将盖玻片浸泡于清洁液中4小时。2将清洁液回收到玻璃容器中，用自来水充分冲洗盖玻片，直到没有颜色为止。3用蒸馏水洗5-10次晾干或放于烤箱中

12、烤干备用。盐酸酸玻璃器皿漂洗液：蒸馏水985ml，盐酸15ml，混合好，标签注明。注意：酸，有腐蚀性。安全措施：戴胶手套，防护眼镜，穿工作服。把酸加到水中，在通风好的地方操作。盐酸：强烈刺激皮肤，眼睛和呼吸道。经过吸收影响目标器官皮肤，呼吸道，生殖和胎儿系统。有腐蚀性。清洗步骤：1倒入玻璃器皿，放置25min。2用蒸馏水漂洗10次。3必要时烤干后使用。常规染色常用的封片剂有DPX、中性树胶（人工合成）和加拿大树胶，可以任选一种。透明后即可从二甲苯中取出来进行封片，切片应在二甲苯透明状态下滴加封片胶，盖上适当大小的盖玻片。组织不要晾干了以后再加胶封片。组织在空气中晾干或烤箱烤干再进行封片，即“干

13、封”，切片晾干了以后封片透明效果肯定不如“湿封”好，因为空气中不但有灰尘还含有水分，空气干燥时对封片影响较小，如果环境潮湿空气中水分较多，“干封”难免不受空气中水分的影响。因为二甲苯不会溶于水，可以隔离空气中的水分，二甲苯挥发后组织和空气直接接触。水分随着空气可以进入组织中，并封闭在组织里，所以，气候潮湿的地方应该避免封片时采用“干封”。封片胶以二甲苯作为溶剂，二甲苯非常容易挥发，如果器密封不紧二甲苯容易挥发，二甲苯挥发后封片胶会变稠。封片胶太稠，封片胶不容易向周围渗透，容易潴留气泡，有气泡的地方显微镜下看不清楚，时间久了气泡下面的组织还会退色。所以封片胶稠度要合适，外观类似蛋清或甘油的状态比较合适。如果封片胶变稠可适当加一些二甲苯，混匀后呈甘油状再使用。胶太稀也不利于封片，胶的粘稠度会降低，刚刚封固的切片稍倾斜时盖玻片很容易溜掉，甚至脱离封固组织的。会产生较大的气泡，二甲苯挥发后组织会裸露。切片放一段时间之后，盖玻片下会出现较大面积不透明的无胶区，有胶的地方组织呈透明状，没有胶的地方组织模糊不清，这种无胶区和气泡一样显微镜下同样看不清楚。多数原因是在胶中加入的二甲苯太多，遇到这种情况时只要让二甲苯自然挥发一段时间，胶的稠度就会变的合适，防止灰尘进入胶当中。封片