HE染色protocol.docx
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HE染色protocol
HE染色protocol
常规HE染色
石蜡包埋的组织切片必须经过脱蜡水洗处理才能染色，让水溶性染料渗入组织中，含蜡的组织切片无法进行任何染色。
所以，在染色前必须用二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，经过乙醇洗后，再用水洗。
即石蜡组织切片→二甲苯→乙醇（无水乙醇，95%，80%）→水。
人们通常把这个过程叫做切片脱蜡至水。
脱蜡至水是染色前的必须完成的基本步骤。
一般脱蜡至水的时间和步骤如下：
HE染色脱蜡至水步骤
步骤顺序
试剂
时间
1
二甲苯Ⅰ脱蜡
5min
2
二甲苯Ⅱ脱蜡
5min
3
二甲苯Ⅲ脱蜡
5min
4
无水乙醇浸洗
1min
5
95%乙醇Ⅰ浸洗
1min
6
95%乙醇Ⅱ浸洗
1min
7
80%乙醇浸洗
1min
8
自来水冲洗
3-5min
冰冻切片和细胞涂片样品的染色不需要经过脱蜡至水步骤，水洗后直接用苏木精和伊红染色。
染色是利用染料的不同作用，使组织与染料以不同方式进行结合。
常规染色是苏木精和伊红染色（H.E）。
特殊染色（specialstains）和组织化学（免役组织化学）染色是根据诊断的需要对组织中的某些成分进行非常规的染色。
HE染色用的苏木精是一种树木苏木的一种氧化产品，因为这种树非常罕见，多数氧化苏木精是合成品。
苏木精必须氧化成熟后才能使用。
苏木精染液需要预先配制，放置几个月自然氧化成熟。
或购买成熟过的商品苏木精，也可在苏木精液中加一些成熟剂。
苏木精本身对组织没有染色作用，需要“媒染剂”与组织连接，媒染剂是铁，铝，钨等由这类正离子金属提供。
矾也是苏木精常用的媒染剂，如Harris苏木精的配制以硫酸铝钾（钾明矾）或铵明矾作为媒染剂。
不同媒染剂配制的苏木精染色强度不同。
苏木精作为一种基础染料对细胞核的核酸具有一定的亲和力。
Mayer苏木精明矾液
10%苏木精乙醇掖
10ml
碘化钠
0.2g
钾明矾或铵矾
50g
水合氯醛
50g
枸橼酸
1g
蒸馏水
1000ml
用蒸馏水溶解固体然后加入苏木精液。
伊红水溶液配制
伊红水溶液
伊红Y
0.5g
蒸馏水
100ml
先用少量蒸馏水溶解伊红，再用玻璃棒搅拌溶解，完全溶解后加入剩余的蒸馏水。
苏木精染色后分化需要的液体
盐酸乙醇液配制
盐酸乙醇液
75%乙醇
0100ml
浓盐酸
0.5ml
苏木精染色后蓝化需要的液体
目的（PURPOSE）
Tobeusedforbluingthehematoxylinstain,followsthedecoloration,acidrinse,inregressivestaining..
蓝化液（BLUINGSOLUTIONS）
1
Scott’sTapWater/Bluing
硫酸镁（MgSO4）
30g
碳酸氢钠
2g
自来水
3000ml
充分混合，标记液体日期。
推荐用于Gill’sⅢ苏木精蓝化。
2
0.05%碳酸锂
碳酸锂
0.5g
蒸馏水
1000ml
充分混合，标记液体日期。
3
氨水
氢氧化铵
5ml
蒸馏水
1000ml
充分混合，标记液体日期。
对事先冻存过的组织会引起脱片。
水蓝化
自来水
流水冲洗
10-30min
手工HE染色方法和步骤
石蜡切片必须经过脱蜡至水。
冰冻切片先经过电吹风吹干，再用冰冻固定液短时间固定，不用经过脱蜡至水直接用自来水冲洗后进行染色。
染色步骤参考表
染色步骤
1
组织切片脱蜡至水
2
Harris苏木精液3～5min
3
自来水洗1min
4
75%盐酸乙醇液分化数秒钟
5
自来水流水冲洗10min至细胞核呈蓝色，也可以使用蓝化液返蓝
6
0.5%伊红水溶液1min
7
95%乙醇Ⅰ脱水1min
8
95%乙醇Ⅱ脱水1min
9
无水乙醇Ⅰ脱水1min
10
无水乙醇Ⅱ脱水1min
11
二甲苯Ⅰ透明1min
12
二甲苯Ⅱ透明1min
13
中性树胶或DPX封固
结果
细胞核蓝色，细胞浆红色，背景粉红色。
自动染色机染色方法和步骤
ShandonVarislainGemini自动染色机使用方法
1.ShandonVarislainGemini自动染色机
染色机有26个试剂槽，6个冲洗水位，5个干燥储存位，附载玻片框、水洗管、碳过滤器等。
可以编制多个染色程序，根据染色机操作菜单编制常用的染色程序，所有准备工作完成后运行染色程序。
2.准备常用的染液和试剂
1二甲苯
275%乙醇
395%乙醇
4无水乙醇
5Mayers苏木精
60.5%伊红水溶液
71%盐酸乙醇
3.编制常规HE染色程序
HE染色程序参考表
项目
试剂
时间
脱蜡
二甲苯Ⅰ
10min
二甲苯Ⅱ
10min
乙醇洗涤
无水乙醇Ⅰ
2min
无水乙醇Ⅱ
2min
95%乙醇
1min
75%乙醇
1min
流水冲洗（搅拌）
1min
苏木精染色
Mayer苏木精
10min
流水冲洗
1min
分化
1%盐酸乙醇
10s
流水冲洗（搅拌）
20min
伊红染色
0.5%伊红水溶液
1min
流水冲洗（搅拌）
1min
脱水
95%乙醇Ⅰ
30s
95%乙醇Ⅱ
30s
无水乙醇Ⅰ
2min
无水乙醇Ⅱ
2min
透明
二甲苯Ⅰ
2min
二甲苯Ⅱ
2min
使用说明
1并根据显示器上的提示在相应试剂槽中加入需要的染液和试剂,每种约300ml。
2石蜡切片80℃烤片，20分钟。
将切片放入装载玻片框里置染色机中。
选择染色程序。
3染色机可以显示染色程序的运行情况，主要信息包括染色开始时间和染色结束时间及染色运行状况等，如果染色程序出现错误，可以随时终止运行。
4染色质量的控制，据中国医科大学使用情况统计，300ml苏木精染色1500-1800张；300ml伊红水溶液染色2500-2800张；300ml其他试剂约处理800-1000张。
需要更换新液。
以便保证染色质量。
5温度低于15℃染色效果不佳。
应该调整室温。
6因为染色用的试剂多为易燃品，染色机应远离火源。
7进水孔要保持通常，需要定时进行清洗。
定时更换碳过滤器。
8染色完成后机器会发出提示声音。
9片按常规中性树胶封片。
4.细胞学涂片HE染色程序
细胞学涂片HE染色程序参考表
项目
试剂
时间
固定
95%乙醇
10min
流水冲洗（搅拌）
1min
苏木精染色
Mayer苏木精
10min
流水冲洗
1min
分化
1%盐酸乙醇
10s
流水冲洗（搅拌）
20min
伊红染色
0.5%伊红水溶液
1min
流水冲洗（搅拌）
1min
脱水
95%乙醇Ⅰ
30s
95%乙醇Ⅱ
30s
无水乙醇Ⅰ
2min
无水乙醇Ⅱ
2min
透明
二甲苯Ⅰ
2min
二甲苯Ⅱ
2min
使用说明
①染色完成后机器会发出提示声音。
②取出切片按常规中性树胶封片。
二封片
切片染色后必须先通过80%、95%和无水系列乙醇脱水，然后经过透明剂透明。
透明完成后在有组织的地方加上中性树胶或DPX，然后用清洁后盖玻片覆盖在组织上。
人们通常把这个过程叫做封片。
从市场上购买的盖玻片一般没有经过清洗，须要清洗处理后才能使用。
根据组织的大小选用。
盖玻片规格参考下表
规格
包装
厚度
18*18mm
100片/合
10合/包
600合/箱
0.13-0.17mm
20*20mm
100片/合
10合/包
600合/箱
0.13-0.17mm
22*22mm
100片/合
10合/包
600合/箱
0.13-0.17mm
24*24mm
100片/合
10合/包
600合/箱
0.13-0.17mm
24*32mm
100片/合
10合/包
400合/箱
0.13-0.17mm
24*50mm
100片/合
10合/包
400合/箱
0.13-0.17mm
盖玻片清洗处理的方法和步骤
玻璃器皿清洁液配制
用途：
主要用于玻璃器皿的清洁。
设备：
4000ml长颈瓶，磁棒，磁力搅拌器6～7升盖着玻璃容器（瓷罐）
试剂：
酸清洁液：
重络酸钾400g，蒸馏水4000ml，硫酸400ml。
用水溶解重络酸钾，把重络酸钾液倒入瓷罐中，慢慢加入硫酸使液体变为棕黑色，按照使用，标明开始使用日期。
注意：
酸。
有腐蚀性，致癌剂。
安全措施：
戴胶手套，防护眼镜，穿工作服。
把硫酸慢慢加到液体里，在通风好的地方操作。
硫酸：
烟雾吸入会有害，影响器官皮肤，呼吸器官，生殖系统和胎儿组织。
刺激皮肤眼睛和呼吸道。
使用硫酸时操作应特别注意，硫要慢慢地加入液体里。
盖玻片清洗步骤
1．拆开盖玻片的包装将盖玻片浸泡于清洁液中4小时。
2．将清洁液回收到玻璃容器中，用自来水充分冲洗盖玻片，直到没有颜色为止。
3．用蒸馏水洗5-10次晾干或放于烤箱中烤干备用。
盐酸酸玻璃器皿漂洗液：
蒸馏水985ml，盐酸15ml，混合好，标签注明。
注意：
酸，有腐蚀性。
安全措施：
戴胶手套，防护眼镜，穿工作服。
把酸加到水中，在通风好的地方操作。
盐酸：
强烈刺激皮肤，眼睛和呼吸道。
经过吸收影响目标器官皮肤，呼吸道，生殖和胎儿系统。
有腐蚀性。
清洗步骤：
1．倒入玻璃器皿，放置2～5min。
2．用蒸馏水漂洗10次。
3．必要时烤干后使用。
常规染色常用的封片剂有DPX、中性树胶（人工合成）和加拿大树胶，可以任选一种。
透明后即可从二甲苯中取出来进行封片，切片应在二甲苯透明状态下滴加封片胶，盖上适当大小的盖玻片。
组织不要晾干了以后再加胶封片。
组织在空气中晾干或烤箱烤干再进行封片，即“干封”，切片晾干了以后封片透明效果肯定不如“湿封”好，因为空气中不但有灰尘还含有水分，空气干燥时对封片影响较小，如果环境潮湿空气中水分较多，“干封”难免不受空气中水分的影响。
因为二甲苯不会溶于水，可以隔离空气中的水分，二甲苯挥发后组织和空气直接接触。
水分随着空气可以进入组织中，并封闭在组织里，所以，气候潮湿的地方应该避免封片时采用“干封”。
封片胶以二甲苯作为溶剂，二甲苯非常容易挥发，如果器密封不紧二甲苯容易挥发，二甲苯挥发后封片胶会变稠。
封片胶太稠，封片胶不容易向周围渗透，容易潴留气泡，有气泡的地方显微镜下看不清楚，时间久了气泡下面的组织还会退色。
所以封片胶稠度要合适，外观类似蛋清或甘油的状态比较合适。
如果封片胶变稠可适当加一些二甲苯，混匀后呈甘油状再使用。
胶太稀也不利于封片，胶的粘稠度会降低，刚刚封固的切片稍倾斜时盖玻片很容易溜掉，甚至脱离封固组织的。
会产生较大的气泡，二甲苯挥发后组织会裸露。
切片放一段时间之后，盖玻片下会出现较大面积不透明的无胶区，有胶的地方组织呈透明状，没有胶的地方组织模糊不清，这种无胶区和气泡一样显微镜下同样看不清楚。
多数原因是在胶中加入的二甲苯太多，遇到这种情况时只要让二甲苯自然挥发一段时间，胶的稠度就会变的合适，防止灰尘进入胶当中。
封片
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