不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响Word格式.docx

1、，迄今尚未见关于影响微生物转氨酶、脱氢酶等细胞活力方面的研究报道。鉴于此，本试验拟选用 4 种植物油脂分别进行体外培养，测定体系中转氨酶、脱氢酶等的活性，以研究饱和程度不同的油脂对微生物细胞活力影响的规律和机制，为反刍动物瘤胃微生态调控技术的研究和实际生产中油脂的使用提供参考。动 物 营 养 学 报 23 卷1 材料与方法1 1 试验动物与饲养管理在扬州大学农牧场选择 3 只 1 5 岁并装有瘤胃瘘管的徐淮白山羊，平均体重为（ 29 7 0 14） kg，用于采集瘤胃液。试验山羊分隔单舍，以玉米、豆粕和羊草为常规饲粮，于07: 00 和19: 00 分2 次饲喂，自由饮水。1 2 试验设计与培

2、养底物试验采用单因子试验设计，共分 5 组，每组 3重复。对照组不加油脂、试验组分别为花生油组、菜籽油组、玉米油组和豆油组。底物组成与油脂碘价见表 1，棕榈酸钙为本实验室生产。表 1 底物组成与油脂碘价Table 1 Composition of substrates and iodine values of oil %项目Items对照组Controlgroup花生油组Peanut oil菜籽油组Rapeseed oil玉米油组Corn oil豆油组Soybean oil碘价Iodinevalue淀粉 Starch 19 19 19 19 19酪蛋白 Casein 10 10 10 10 1

3、0纤维素 Cellulose 67 67 67 67 67棕榈酸钙 Calcium palmitate 4花生油 Peanut oil 4 94 1菜籽油 Rapeseed oil 4 114 5玉米油 Corn oil 4 131 3豆油 Soybean oil 4 143 7合计 Total 100 100 100 100 100碘价为实测值。Iodine values were all measured values1 3 体外培养与取样设计参考 Menke 等7的方法。配制好培养液（ 人工唾液盐瘤胃液 = 21） ，通入 CO2，39 水浴预热。按照试验设计准确称取 2 0 g 底物置

4、于培养瓶中，分别加入 150 mL 培养液。通入 CO，39 恒温水浴震荡培养。分别在培养后 0、4、8、12、16、24 h 取样，每次取约 15 mL 培养液，分装于 3 支离心管，其中 1 支立即离心并取上清液用于测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶的酶活; 1 支立即离心并用于测定总脱氢酶酶活; 1 只立即于 20 冷冻保存，待分离微生物与微生物 DNA 的测定。1 4 测定指标及方法1 4 1 谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶测定各个时点取样后立即 7 000 r/mim 离心 15 min离心，并取上清液送江苏省苏北人民医院，采用全生化分析仪测定。1 4 2 总脱氢酶活性测定参

5、考 Humeyan 等8的方法，并略有改进。取100 目尼龙布过滤的新鲜培养液 2 mL 于试管中，加入 0 2 mL 1 5% 的氯化三苯四氮唑（ TTC） 反应，而对照管先加入 5 mL 异丙醇抑制酶反应。在厌氧条件下恒温水浴（ 38 39 ） 10 min。试验组加入 5 mL 异丙醇终止反应后，以 4 000 r/mim 离心 10 min。上清液稀释 15 倍，于分光光度计在485 nm 处比色。酶活单位定义为在 38 5 、pH6 8 条件下，每分钟引起测定液吸光度上升 0 1 的酶量为 1 个酶活单位。酶活单位（ U /mL） = （ 样品 A485 nm /min 对照A485

6、 nm /min） 15。1 4 3 微生物分离与其 DNA 的测定依据差速离心原理分离微生物，具体步骤为:1） 原虫: 取瘤胃液加等体积生理盐水置于恒温（ 39 ） 水 浴 锅 中 震 荡 （ 125 r/min） 水 浴 孵 育60 min，并辅以搅拌，再经 4 层纱布过滤，滤液离心（ 400 r/mim 离心 10 min） ，收集沉淀为原虫，用生理盐水洗涤 2 次后用生理盐水悬浮， 20 贮存待测。2） 细菌: 收集上述 1） 中离心后的上清液，再高速离心（ 15 000 r/mim 离心 15 min） ，收集沉淀为细菌，其余处理同 1） 中所述。微生物 DNA 测定原理: 微生物体

7、内 DNA 所占比例比 RNA 或蛋白质等成分更为恒定，利用微生物的 DNA 量来代表微生物的总量更加科学。DNA 二苯胺显色后其 595 nm 处的吸光度与样品13108 期 王 曙等: 不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响中含量成线性关系，线性范围为 40 400 g /mL，据此将待测样品释至线性范围内测定其光密度值、再据标准品测定得到的标准曲线即可查得样品浓度。微生物 DNA 测定采用二苯胺显色法并参照赵亚华9的步骤。制备小牛胸腺 DNA 钠盐（ 上海生工公司） 标准溶液，制作以 DNA 量为横坐标，吸光度值为纵坐标的标准曲线。以样品的吸光度值从标准曲线上查出相对应

8、 DNA 含量。1 5 统计分析Excel 整理数据和作图，用 SPSS v16 0 软件中compare mean 的 One-w ay-ANOVA 过程进行方差分析和 Tukey 多重比较。2 结果与分析2 1 转氨酶及脱氢酶随时间的动态变化由表 2 和表 3 可见，培养液谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶等随培养时间的延长大体上都不断提高，其中以菜籽油组变化幅度最大、豆油组次之，并且该 2 组持续在远高于对照组和其他油脂组的水平上变化; 而玉米油组与花生油组与对照组接近，变化幅度不大。各个时间点比较，其中谷草转氨酶、谷丙转氨酶随时间变化的幅度较大，同一组的随时间变化有显著变化（ P 0

9、05） ;而乳酸脱氢酶随时间变化的幅度不大，同一组的各个时间点间没有显著差异（ P 0 05） 。由表 3 可见，随着培养时间的延长，各组培养液总脱氢酶的活性有显著增长的趋势（ P 0 05） ，除玉米组外，都以 16 h 的该酶活性最高，而后又略有下降。各组间变化不尽一致，其中以豆油组增长幅度最大，其次依次为玉米油组、花生油组、对照组和菜籽油组，总体看来仅菜籽油组的总脱氢酶活性在培养过程中持续低于对照组。表 2 培养液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化Table 2 The activities of GOT and GPT in culture solution IU / L时间 Time

10、/h0 4 8 16 24SEMP 值P-value谷草转氨酶GOTControl group9 67 0 58b8 67 10 33 1 1512 33 a0 596 0 001Peanut oil group14 33 15 33 14 00 1 0016 33 ab18 67 0 760 0 001Rapeseed oil group107 00 2 65c108 67 2 31107 33 4 62123 33 5 86142 67 4 513 432 0 000Corn oil group26 67 1 5329 33 27 67 35 00 2 0037 67 2 081 333

11、0 000Soybean oil group58 67 66 33 3 5164 00 1 73bc65 33 1 5272 33 1 764 0 000谷丙转GPT16 00 18 33 17 00 0 789 0 01724 00 24 67 25 33 29 67 1 095 0 002147 67 7 02175 00 7 00176 67 4 93188 67 201 33 8 085 270 0 00047 33 51 00 4 0049 33 53 33 64 67 3 792 201 0 00082 67 95 00 90 33 93 67 102 00 2 642 366 0

12、 000同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著（ P 0 05） ，相邻小写字母表示差异显著（ P 0 05） ，相间小写字母表示差异极显著（ P 0 01） 。下表同。In the same row ，values w ith the same small letter superscripts mean no significant difference （ P 0 05） ，w ith adjacentsmall letter superscripts mean significant difference （ P 0 05） ，w hile w ith alternate small

13、letter superscripts mean extremely dif-ferent （ P 0 01） The same as below 1311动 物 营 养 学 报 23 卷表 3 培养液中乳酸脱氢酶和总脱氢酶的活性变化Table 3 The activities of LDH and total dehydrogenase in culture solution乳酸脱氢酶LDH /（ IU /L）0 007 0 0060 003 0 000 0 0000 013 0 0150 006 0 2560 010 0 0100 023 0 006 0 0680 030 0 0020 0

14、33 0 060 0 009 0 0110 017 0 0120 008 0 5070 027 0 020 0 010 0 509总脱氢酶Total dehydro-genase /（ U /L）0 543 0 0210 747 0 863 0 0320 897 0 0050 840 0 0360 027 0 0000 490 0 0620 890 0 963 0 0381 050 0 0460 883 0 036 0 0000 437 e0 547 0 025d0 790 0 0170 663 0 447 1 043 0 0551 103 1 063 1 013 0 0670 039 0 0

15、000 443 0 0291 077 0 0451 153 0 0491 213 0 0511 183 0 041 0 0002 2 油脂对转氨酶、脱氢酶均值的影响由表 4 可见，各组间培养液乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶在各组间有显著差异（ P 0 05） 。3 种酶都以菜籽油组最高、其次依次为豆油组、玉米油组、花生油组，除花生油组与对照组差异不显著外（ P 0 05） ，其他油脂组都显著高于对照组（ P 0 05） 。总脱氢酶组间差异显著（ P 0 05） 。其中总脱氢 酶 以 豆 油 组 最 高，显 著 高 于 对 照 组 （ P 0 05） 、玉米油组次之、花生油组再次之，菜籽油组

16、最低，在数值上低于对照组，但差异不显著（ P 2 3 油脂对培养液原虫、细菌区系的影响由表 4 还可知，培养液原虫、细菌、微生物DNA，以及原虫 / 细菌区系比例的均值与对照组差异不显著（ P 0 05） ，添加油脂的试验组间也没有显著差异（ P 0 05） ; 但本试验中脱氢酶、转氨酶等动态指标在时间点间基本均有显著变化趋势（ 表 2、3） ，而且同时进行的各时间点微生物 DNA及原虫/细菌区系比例测定也表明，各组的微生物DNA、原虫 / 细菌比例（ 图 1、2） 随时间都有显著或极显著的变化（ P 0 05、P 0 01） 。这说明了微生物在培养过程中其区系、活力等都发生了变化，而要考察体

17、系中微生物的客观情况不仅要考察其均值或终点值，还要考察其动态指标; 同时也表明，在本试验的各组培养过程中微生物的量与活力虽然有较大的动态变化，但微生物的均产量受到的影响不大。可通过调节微生物的活力改变其发酵状态，而不影响微生物蛋白产量。3 讨 论3 1 油脂对转氨酶和乳酸脱氢酶活性的影响谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶等一般在胞内的浓度远远高于胞外，但若细胞受损、胞膜破坏将导致胞外的浓度上升。在本研究中，各组培养液乳酸脱氢酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶等随时间培养时间的延长皆不断提高，其原因可能即是在培养过程中随时间的延长微生物与代谢物的积累而微生物细胞自溶导致细胞壁、细胞膜的破坏而释放上述的酶

18、所致10 11其中以菜籽油组的变化幅度最大、豆油组次之，玉米油组与花13128 期 王 曙等:生油组与对照组接近，变化幅度不大。可能是由于植物油脂的不饱和脂肪酸对原虫或细菌具有一定的负效应，而且不饱和程度越高其负效应越大所致2本试验也表明碘价最高的豆油组其培养液转氨酶、乳酸脱氢酶的活性较碘价较低的玉米油组、花生油组高，其微 生 物 细 胞 的 破 损 更 为严重。表 4 4 种油脂对培养液酶活及微生物区系的影响Table 4 Effects of the 4 kinds of oils on enzyme activity and micro flora in culture solution

19、谷草转氨酶GOT / （ IU / L）10 13 1 4115 73 1 91117 80 14 7731 27 4 674 892 680 0 000谷丙转氨酶GPT / （ IU / L）17 20 1 4225 53 2 47177 87 19 2453 13 6 7192 73 6 973 548 0 000LDH / （ IU / L）0 006 0 0070 012 0 0090 034 0 004 0 000Total dehydrogenase /（ U /mL）0 778 0 1350 853 0 2010 665 0 1710 934 0 2571 014 0 3020 081 0 001原虫 DNAProtozoa DNA /（ mg /mL）0 0030 009 0 008 0 001 0 411细菌 DNABacteria DNA /0 025 0 0080 026 0 028 0 003 0 541微生物 D