不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响Word格式.docx
《不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响Word格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响Word格式.docx(35页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
,迄今尚未见关于
影响微生物转氨酶、脱氢酶等细胞活力方面的研
究报道。
鉴于此,本试验拟选用4种植物油脂分
别进行体外培养,测定体系中转氨酶、脱氢酶等的
活性,以研究饱和程度不同的油脂对微生物细胞
活力影响的规律和机制,为反刍动物瘤胃微生态
调控技术的研究和实际生产中油脂的使用提供参考。
动物营养学报23卷
1材料与方法
1.1试验动物与饲养管理
在扬州大学农牧场选择3只1.5岁并装有瘤
胃瘘管的徐淮白山羊,平均体重为(29.7±
0.14)kg,
用于采集瘤胃液。
试验山羊分隔单舍,以玉米、豆
粕和羊草为常规饲粮,于07:
00和19:
00分2次饲
喂,自由饮水。
1.2试验设计与培养底物
试验采用单因子试验设计,共分5组,每组3
重复。
对照组不加油脂、试验组分别为花生油组、
菜籽油组、玉米油组和豆油组。
底物组成与油脂
碘价见表1,棕榈酸钙为本实验室生产。
表1底物组成与油脂碘价
Table1Compositionofsubstratesandiodinevaluesofoil%
项目
Items
对照组
Control
group
花生油组
Peanutoil
菜籽油组
Rapeseedoil
玉米油组
Cornoil
豆油组
Soybeanoil
碘价
Iodine
value
淀粉Starch1919191919
酪蛋白Casein1010101010
纤维素Cellulose6767676767
棕榈酸钙Calciumpalmitate4
花生油Peanutoil494.1
菜籽油Rapeseedoil4114.5
玉米油Cornoil4131.3
豆油Soybeanoil4143.7
合计Total100100100100100
碘价为实测值。
Iodinevalueswereallmeasuredvalues.
1.3体外培养与取样设计
参考Menke等
[7]
的方法。
配制好培养液(人
工唾液盐∶瘤胃液=2∶1),通入CO
2
,39℃水浴预
热。
按照试验设计准确称取2.0g底物置于培养
瓶中,分别加入150mL培养液。
通入CO
,39℃
恒温水浴震荡培养。
分别在培养后0、4、8、12、16、24h取样,每次
取约15mL培养液,分装于3支离心管,其中1支
立即离心并取上清液用于测定谷丙转氨酶、谷草
转氨酶、乳酸脱氢酶的酶活;
1支立即离心并用于
测定总脱氢酶酶活;
1只立即于-20℃冷冻保存,
待分离微生物与微生物DNA的测定。
1.4测定指标及方法
1.4.1谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶测定
各个时点取样后立即7000r/mim离心15min
离心,并取上清液送江苏省苏北人民医院,采用全
生化分析仪测定。
1.4.2总脱氢酶活性测定
参考Humeyan等
[8]
的方法,并略有改进。
取
100目尼龙布过滤的新鲜培养液2mL于试管中,
加入0.2mL1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)反
应,而对照管先加入5mL异丙醇抑制酶反应。
在
厌氧条件下恒温水浴(38~39℃)10min。
试验组
加入5mL异丙醇终止反应后,以4000r/mim离
心10min。
上清液稀释15倍,于分光光度计在
485nm处比色。
酶活单位定义为在38.5℃、pH
6.8条件下,每分钟引起测定液吸光度上升0.1的
酶量为1个酶活单位。
酶活单位(U/mL)=(样品A485nm/min-
对照A485nm/min)×
15。
1.4.3微生物分离与其DNA的测定
依据差速离心原理分离微生物,具体步骤为:
1)原虫:
取瘤胃液加等体积生理盐水置于恒温
(39℃)水浴锅中震荡(125r/min)水浴孵育
60min,并辅以搅拌,再经4层纱布过滤,滤液离心
(400r/mim离心10min),收集沉淀为原虫,用生
理盐水洗涤2次后用生理盐水悬浮,-20℃贮存
待测。
2)细菌:
收集上述1)中离心后的上清液,
再高速离心(15000r/mim离心15min),收集沉
淀为细菌,其余处理同1)中所述。
微生物DNA测定原理:
微生物体内DNA所
占比例比RNA或蛋白质等成分更为恒定,利用微
生物的DNA量来代表微生物的总量更加科学。
DNA二苯胺显色后其595nm处的吸光度与样品
13108期王曙等:
不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响
中含量成线性关系,线性范围为40~400μg/mL,
据此将待测样品释至线性范围内测定其光密度
值、再据标准品测定得到的标准曲线即可查得样
品浓度。
微生物DNA测定采用二苯胺显色法并
参照赵亚华
[9]
的步骤。
制备小牛胸腺DNA钠盐
(上海生工公司)标准溶液,制作以DNA量为横
坐标,吸光度值为纵坐标的标准曲线。
以样品的
吸光度值从标准曲线上查出相对应DNA含量。
1.5统计分析
Excel整理数据和作图,用SPSSv16.0软件中
comparemean的One-way-ANOVA过程进行方差
分析和Tukey多重比较。
2结果与分析
2.1转氨酶及脱氢酶随时间的动态变化
由表2和表3可见,培养液谷草转氨酶、谷丙
转氨酶、乳酸脱氢酶等随培养时间的延长大体上
都不断提高,其中以菜籽油组变化幅度最大、豆油
组次之,并且该2组持续在远高于对照组和其他
油脂组的水平上变化;
而玉米油组与花生油组与
对照组接近,变化幅度不大。
各个时间点比较,其
中谷草转氨酶、谷丙转氨酶随时间变化的幅度较
大,同一组的随时间变化有显著变化(P<0.05);
而乳酸脱氢酶随时间变化的幅度不大,同一组的
各个时间点间没有显著差异(P>0.05)。
由表3可见,随着培养时间的延长,各组培养
液总脱氢酶的活性有显著增长的趋势(P<0.05),
除玉米组外,都以16h的该酶活性最高,而后又略
有下降。
各组间变化不尽一致,其中以豆油组增
长幅度最大,其次依次为玉米油组、花生油组、对
照组和菜籽油组,总体看来仅菜籽油组的总脱氢
酶活性在培养过程中持续低于对照组。
表2培养液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化
Table2TheactivitiesofGOTandGPTinculturesolutionIU/L
时间Time/h
0481624
SEM
P值
P-value
谷草转
氨酶
GOT
Controlgroup
9.67±
0.58
b
8.67±
10.33±
1.15
12.33±
a
0.5960.001
Peanutoilgroup
14.33±
15.33±
14.00±
1.00
16.33±
ab
18.67±
0.7600.001
Rapeseedoilgroup
107.00±
2.65
c
108.67±
2.31
107.33±
4.62
123.33±
5.86
142.67±
4.51
3.4320.000
Cornoilgroup
26.67±
1.53
29.33±
27.67±
35.00±
2.00
37.67±
2.08
1.3330.000
Soybeanoilgroup
58.67±
66.33±
3.51
64.00±
1.73
bc
65.33±
1.52
72.33±
1.7640.000
谷丙转
GPT
16.00±
18.33±
17.00±
0.7890.017
24.00±
24.67±
25.33±
29.67±
1.0950.002
147.67±
7.02
175.00±
7.00
176.67±
4.93
188.67±
201.33±
8.08
5.2700.000
47.33±
51.00±
4.00
49.33±
53.33±
64.67±
3.79
2.2010.000
82.67±
95.00±
90.33±
93.67±
102.00±
2.64
2.3660.000
同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),相邻小写字母表示差异显著(P<0.05),相间小写字母表示
差异极显著(P<0.01)。
下表同。
Inthesamerow,valueswiththesamesmalllettersuperscriptsmeannosignificantdifference(P>0.05),withadjacent
smalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05),whilewithalternatesmalllettersuperscriptsmeanextremelydif-
ferent(P<0.01).Thesameasbelow.
1311动物营养学报23卷
表3培养液中乳酸脱氢酶和总脱氢酶的活性变化
Table3TheactivitiesofLDHandtotaldehydrogenaseinculturesolution
乳酸脱氢酶
LDH/
(IU/L)
0.007±
0.006
0.003±
0.000±
0.000
0.013±
0.015
0.0060.256
0.010±
0.010
0.023±
0.0060.068
0.030±
0.002
0.033±
0.060±
0.0090.011
0.017±
0.012
0.0080.507
0.027±
0.020±
0.0100.509
总脱氢酶
Totaldehydro-
genase/
(U/L)
0.543±
0.021
0.747±
0.863±
0.032
0.897±
0.005
0.840±
0.036
0.0270.000
0.490±
0.062
0.890±
0.963±
0.038
1.050±
0.046
0.883±
0.0360.000
0.437±
e
0.547±
0.025
d
0.790±
0.017
0.663±
0.447±
1.043±
0.055
1.103±
1.063±
1.013±
0.067
0.0390.000
0.443±
0.029
1.077±
0.045
1.153±
0.049
1.213±
0.051
1.183±
0.0410.000
2.2油脂对转氨酶、脱氢酶均值的影响
由表4可见,各组间培养液乳酸脱氢酶、谷草
转氨酶、谷丙转氨酶在各组间有显著差异(P<
0.05)。
3种酶都以菜籽油组最高、其次依次为豆
油组、玉米油组、花生油组,除花生油组与对照组
差异不显著外(P>0.05),其他油脂组都显著高于
对照组(P<0.05)。
总脱氢酶组间差异显著(P<0.05)。
其中总
脱氢酶以豆油组最高,显著高于对照组(P<
0.05)、玉米油组次之、花生油组再次之,菜籽油组
最低,在数值上低于对照组,但差异不显著(P>
2.3油脂对培养液原虫、细菌区系的影响
由表4还可知,培养液原虫、细菌、微生物
DNA,以及原虫/细菌区系比例的均值与对照组差
异不显著(P>0.05),添加油脂的试验组间也没有
显著差异(P>0.05);
但本试验中脱氢酶、转氨酶
等动态指标在时间点间基本均有显著变化趋势
(表2、3),而且同时进行的各时间点微生物DNA
及原虫/细菌区系比例测定也表明,各组的微生物
DNA、原虫/细菌比例(图1、2)随时间都有显著或
极显著的变化(P<0.05、P<0.01)。
这说明了微
生物在培养过程中其区系、活力等都发生了变化,
而要考察体系中微生物的客观情况不仅要考察其
均值或终点值,还要考察其动态指标;
同时也表
明,在本试验的各组培养过程中微生物的量与活
力虽然有较大的动态变化,但微生物的均产量受
到的影响不大。
可通过调节微生物的活力改变其
发酵状态,而不影响微生物蛋白产量。
3讨论
3.1油脂对转氨酶和乳酸脱氢酶活性的影响
谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶等一
般在胞内的浓度远远高于胞外,但若细胞受损、胞
膜破坏将导致胞外的浓度上升。
在本研究中,各
组培养液乳酸脱氢酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶
等随时间培养时间的延长皆不断提高,其原因可
能即是在培养过程中随时间的延长微生物与代谢
物的积累而微生物细胞自溶导致细胞壁、细胞膜
的破坏而释放上述的酶所致
[10-11]
其中以菜籽
油组的变化幅度最大、豆油组次之,玉米油组与花
13128期王曙等:
生油组与对照组接近,变化幅度不大。
可能是由
于植物油脂的不饱和脂肪酸对原虫或细菌具有一
定的负效应,而且不饱和程度越高其负效应越大
所致
[2]
本试验也表明碘价最高的豆油组其培养
液转氨酶、乳酸脱氢酶的活性较碘价较低的玉米
油组、花生油组高,其微生物细胞的破损更为
严重。
表44种油脂对培养液酶活及微生物区系的影响
Table4Effectsofthe4kindsofoilsonenzymeactivityandmicroflorainculturesolution
谷草转氨酶
GOT/(IU/L)
10.13±
1.41
15.73±
1.91
117.80±
14.77
31.27±
4.67
4.89
2.6800.000
谷丙转氨酶
GPT/(IU/L)
17.20±
1.42
25.53±
2.47
177.87±
19.24
53.13±
6.71
92.73±
6.97
3.5480.000
LDH/(IU/L)
0.006±
0.007
0.012±
0.009
0.034±
0.0040.000
Totaldehydrogenase/
(U/mL)
0.778±
0.135
0.853±
0.201
0.665±
0.171
0.934±
0.257
1.014±
0.302
0.0810.001
原虫DNA
ProtozoaDNA/
(mg/mL)
0.003
0.009±
0.008±
0.0010.411
细菌DNA
BacteriaDNA/
0.025±
0.008
0.026±
0.028±
0.0030.541
微生物D