英文文献翻译Word文档格式.docx

1、2010年11月14日/接收日期：2011年2月28日/在线发布时间：2011年4月13日 日本水产科学2011年 摘要：测定大黄及其主要生物活性化合物对嗜水气单胞菌的抑菌性能。采集不同种植区的大黄，对其主要生物活性化合物（蒽醌衍生物）进行超高效液相色谱（UPLC）测定；大黄的抗菌活性最低抑菌浓度（MIC）与蒽醌含量（r = 0.9306，P 99）由科密欧化学试剂公司（中国上海）提供。离心柱基因组DNA提取试剂盒购自加拿大Bio Basic公司。细胞PI凋亡检测试剂盒购自中国南京注册机生物技术有限公司。溴化乙锭（EB）是购自Amersco公司（梭伦，OH，USA）。超高效液相色谱级甲醇购自S

2、igma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。其它分析级试剂均由中国上海国药集团化学试剂有限公司提供。蒽醌类化合物的提取 干燥大黄研磨成细粉，并通过筛子（60目）通过。大黄粉末（10.0g）用100ml 80乙醇混合，并进行萃取，在80下加热2h，并重复三次。合并提取液，过滤，然后用旋转蒸发器在40下减压浓缩，并用冷冻干燥机冷冻干燥（LGJ-10D；四环科学仪器（北京）有限公司，中国）。然后将粗提取物样品储存于4冰箱直至使用。超高效液相色谱分析 超高效液相色谱（UPLC）分析使用配备有Waters的Acquity PDA检测器（美国Waters公司），并采用Acquity UPLC

3、TM BEH C18柱（100mm2.1mm，颗粒尺寸1.7m的超高效液相色谱仪；美国Waters公司）。柱箱温度固定在45。洗提液为：A，水0.1甲酸，B，乙腈/甲醇（20:80，V / V）。梯度程序为：10-30B（15min），30-100B（18min）以0.3/min恒定流动。当蒽醌化合物的峰值在280nm处时进行监测。在线记录从200到600nm的UPLC分析紫外可见吸收光谱。嗜水气单基因组DNA的提取 使用离心柱基因组DNA分离试剂盒从嗜水TPS-30中提取DNA。提取DNA的纯度通过吸光度比A 260/A 280（OD260/OD280 = 1.83）进行检查。DNA的浓度用

4、UV-2100分光光度计（信息中心）14在260nm处的吸光度（A 260 = 1.0外径为50g/ml）来确定。抗菌活性（MIC） 大黄提取物，其主要成分（蒽醌衍生物）的抗菌活性通过使用双重微量肉汤稀释法15测定。将生长至对数中期的肉汤在37下培养16小时，采用两倍稀释法将80l的测试样品转移到试管中，使最终浓度分别为6400，3200，1600，800，400，200，100，50，25，12.5，6.25和0g/ml，这就是以往装满1900l的LB培养基。细菌悬浮液（20l）加到每个试管中形成单位为106（CFU）/ ml的最终浓度。将试管在37下放置24小时。培养后，微生物的生长是通过

5、估算浊度的增加来确定的，用UV-2100分光光度仪在630 nm处测量MIC。计算菌株的完全抑制的最高稀释度。所有分析一式三份，并将各自的中值用于数据分析。细菌膜通透性 嗜水气单胞菌TPS-30，生长至对数中期，在37培养16小时，并收集，洗涤，并重新悬浮于1ml的去离子水中（吸光度在630nm处调节至0.2）。 将大黄素样品溶液2试管（10l）在37中放置任意时间。然后，将细胞悬浮液以10000rpm离心10min，并且将上清液稀释至100倍16。释放钾离子的量即由原子吸收光谱仪（美国Varian公司光谱学与机管局220）测定。透射电子显微镜 指数细菌与2 MIC大黄素在37下培养4小时后，

6、通过离心收集，去离子水洗涤两次。处理后，将细菌沉淀物固定，固定在2.5的戊二醛缓冲液中1小时。然后将细胞固定在1的四氧化锇缓冲液中1h，用1乙酸双氧铀将整块染色，脱水，分级乙醇浓度，并随后嵌入骨刺树脂。所用的缓冲液为0.1M的二甲胂酸钠（pH7.4）。制备聚乙烯醇缩甲醛的铜网切片，并用2醋酸双氧铀和柠檬酸铅17染色。青霉素作为阳性对照，和双蒸水作为阴性对照。正常工作条件下，用透射电子显微镜（H-7000；日本日立公司）进行观察。流式细胞仪分析 大黄素治疗后膜的完整性是使用碘化丙啶的流式细胞术分析 （PI）为探针 18 的。嗜水TPS-30，生长至对数期和大黄素在2 MIC的浓度混合4h，用磷酸

7、盐缓冲盐水（PBS）在37下洗涤细胞3次，并重新悬浮于106 CFU / ml的缓冲液中。37温度条件下，在大黄素处理过的细胞培养中的PI溶液（50g/ ml的终浓度）处理30min，随后多次用PBS洗涤除去未结合的染料。PI是在488nm处使用氩激光，将得到的荧光发射通过一个660-nm的长通滤光器收集。青霉素作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照。使用FACScan仪器（刀魂，BO，USA）进行流式细胞分析。荧光测量 大黄素在没有和嗜水基因结合时存在的荧光光谱测量，使用F-7000荧光光度计（日本日立公司），在室温下激发波长为290nm（KEX = 290nm）。从360至560nm的荧光光谱的

8、变化，测定为增加浓度（0，5.0，10.0和20mg/mL），加入大黄素与固定浓度（200mg/mL）19的Tris-HCl缓冲液（10mM，pH 7.2）的样品作为空白溶液，可用于所有样品。有竞争力的大黄素约束力和EB细菌脱氧核糖核酸竞争性结合的荧光测定，使用F-7000荧光光度计（日本日立公司）。将DNA溶解于2ml的Tris-HCl缓冲液（10mM，pH 7.2）中，将10g/ ml，10l EB（2M）溶液加入到DNA溶液后，在EB-DNA溶液置于37的恒温水中10分钟。不同浓度的大黄素（0，50，100，和200g/ml）加入到EB-DNA溶液，30分钟后，用荧光光谱测定各试验溶液，

9、激发535nm处，记录从550到720 nm的20，21光谱。此试验是在一个1厘米长度的石英池中进行。KI荧光猝灭 本实验是根据由郭某人19和宋某等22人描述的方法进行并稍做修改。大黄素的浓度调整为200g/ml；碘化钾（KI）溶解在Tris-HCl缓冲液（10mM，pH 7.2）中，最终至浓度为0，1，2，4，6，8，和10mmol的不同浓度。然后将不同浓度的碘化钾加入含有或不含DNA（10 g/mL）的大黄素溶液中。发射360至560nm的光谱并固定290nm激发波长。数据绘制按照Stern-Volmer方程23 F0/F=1+KSVQ；其中F0和F分别是在荧光强度下DNA的不存在或存在，

10、 KSV是斯特恩涹莫猝灭常数，Q是浓度的淬灭剂。结果大黄蒽醌类化合物的测定 大黄粗提取物的超高效液相色谱分析结果示于表1和图2。从不同种植区采集的5种大黄蒽醌类化合物的总含量范围为5.870.30至24.860.81mg/g。大黄的抗菌活性（MIC）与蒽醌含量相关（r = 0.9306，P 大黄素甲醚=大黄酚。考虑到抗菌活性和大黄素的含量，大黄素被选为该类抗菌机理的候选蒽醌衍生物。表2 五种蒽醌对嗜水气单胞菌的抗菌活性大黄素对嗜水细菌膜的透过性，通过大黄素处理后的细胞释放的钾离子的量的影响作为测定。当细菌细胞膜被破坏，在一定程度上，小的离子，如钾和磷酸倾向于滤出，我们可以监测从细胞中释放的胞质

11、成分。图3显示了细菌细胞培养后钾流出，诱导后钾离子外流显著。而增加孵育时间0.54h，当时间进一步增加，对轻微的变化进行了观察。为钾离子经过处理后释放量增加提供了证据，这就说明大黄素可能作用于细胞膜增加通透性，进而引起细胞离子泄漏。图3 大黄素对K离子嗜水TPS-30释放量的影响。细胞用大黄素预定次数处理，测定细胞中K离子的释放相对量在透射电子显微镜下观察，用大黄素处理过的细菌细胞的形态学变化。电子显微照片见图4。未经处理细菌的对照细胞保持完整，并呈现出光滑的表面（图4a）。而且，培养4h后，该细胞表现出重要的形态变化，例如细胞壁和膜破坏，而且观察到细胞胞质内容物泄漏（图4b，c）中，它类似于在先前的研究25。图4 嗜水TPS-30大黄素处理（b）或青霉素（C，阳性对照），以及未处理的透射电子显微镜观测（一）调查大黄素的抗菌作用是否作用于损伤的质膜中，细胞与大黄素和PI。 PI是一种荧光染料，可嵌入到核酸的可行性标记，这是为了穿透细胞并污染其丧失完整性的膜 26。检测单个细胞内部的PI是通过流式细胞仪分析。如图5，而