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2010年11月14日/接收日期：

2011年2月28日/在线发布时间：

2011年4月13日日本水产科学2011年

摘要：

测定大黄及其主要生物活性化合物对嗜水气单胞菌的抑菌性能。

采集不同种植区的大黄，对其主要生物活性化合物（蒽醌衍生物）进行超高效液相色谱（UPLC）测定；

大黄的抗菌活性[最低抑菌浓度（MIC）]与蒽醌含量（r=0.9306，P<

0.01）呈正比关系。

五个嗜水蒽醌类化合物的MIC值范围在50-200μg/mL。

动作模式研究表明，蒽醌类（大黄素）穿透细胞膜后结合细胞DNA，导致细胞死亡。

目前的研究表明，蒽醌类大黄提取物作为抗菌剂对嗜水的控制具有潜在用途。

关键词：

大黄、嗜水气单胞菌、UPLC、抗菌性能

介绍：

嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）属于弧菌科、气单胞菌属，广泛分布于淡水，污水，污泥，土壤和食品中。

是一种重要的鱼类细菌病原体，并与其余几个鱼类疾病，如出血性败血症，鳍和尾腐烂，流行性溃疡综合征相关[1，2]。

这些疾病已引起淡水鱼高死亡率，导致世界各地广泛损失。

用于控制这些疾病的抗生素和化疗药物可能会导致抗药性细菌的发展，环境污染，残留的鱼。

随着对有机水产养殖的需求不断增加，在水产养殖中使用比抗生素副作用小的天然产品颇受欢迎[3-6]。

大黄是一种重要的中国草药（称为大黄），在中国已长时间被广泛作为植物药物进行治疗气血凝滞，便秘，精神疾病和肾脏疾病，以及代替泻药。

大黄，蒽醌衍生物[大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚（图1）和其糖苷]被认为是主要的活性成分，具有多种不同的生物活性和药理性质，如抗氧化剂[7]，抗菌[8]，抗病毒[9]，抗真菌[10]，抗动脉硬化[11]，和抗癌活性[12]。

由于其生物效应，人们越来越愿意购买这些药物。

近期文献表明，大黄能促进鱼和虾非特异性免疫系统功能，防止致病性感染，缓解拥挤压力的负面影响，促进生长[6,13]。

以往所有的历史研究主要在于筛选大黄及其主要组成部分的抗菌活性和嗜水性，也出现了很多对其作用机制的报道，但很少讨论其抗菌成分。

图1五种蒽醌结构

因此，本次工作目的是：

（1）从大黄及其主要成分中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的提取物；

（2）检测不同种植区采集的大黄五种蒽醌；

（3）调查嗜水蒽醌的作用机制。

材料和方法

微生物和化学品/试剂

嗜水气单胞菌TPS-30，BSK-10是由浙江省淡水水产研究所提供，IB101，JG101，4LNS301，CCH201，LNB101，CG101是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心惠赠；

八大黄样品在中国大黄品种产地附近的市场采购。

大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚（纯度>

99％）由科密欧化学试剂公司（中国上海）提供。

离心柱基因组DNA提取试剂盒购自加拿大BioBasic公司。

细胞PI凋亡检测试剂盒购自中国南京注册机生物技术有限公司。

溴化乙锭（EB）是购自Amersco公司（梭伦，OH，USA）。

超高效液相色谱级甲醇购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。

其它分析级试剂均由中国上海国药集团化学试剂有限公司提供。

蒽醌类化合物的提取

干燥大黄研磨成细粉，并通过筛子（60目）通过。

大黄粉末（10.0g）用100ml80％乙醇混合，并进行萃取，在80℃下加热2h，并重复三次。

合并提取液，过滤，然后用旋转蒸发器在40℃下减压浓缩，并用冷冻干燥机冷冻干燥（LGJ-10D；

四环科学仪器（北京）有限公司，中国）。

然后将粗提取物样品储存于4℃冰箱直至使用。

超高效液相色谱分析

超高效液相色谱（UPLC）分析使用配备有Waters的AcquityPDA检测器（美国Waters公司），并采用AcquityUPLCTMBEHC18柱（100mm×

2.1mm，颗粒尺寸1.7μm的超高效液相色谱仪；

美国Waters公司）。

柱箱温度固定在45℃。

洗提液为：

A，水0.1％甲酸，B，乙腈/甲醇（20:

80，V/V）。

梯度程序为：

10％-30％B（15min），30-100％B（18min）以0.3/min恒定流动。

当蒽醌化合物的峰值在280nm处时进行监测。

在线记录从200到600nm的UPLC分析紫外—可见吸收光谱。

嗜水气单基因组DNA的提取

使用离心柱基因组DNA分离试剂盒从嗜水TPS-30中提取DNA。

提取DNA的纯度通过吸光度比A260/A280（OD260/OD280=1.83）进行检查。

DNA的浓度用UV-2100分光光度计（信息中心）[14]在260nm处的吸光度（A260=1.0外径为50μg/ml）来确定。

抗菌活性（MIC）

大黄提取物，其主要成分（蒽醌衍生物）的抗菌活性通过使用双重微量肉汤稀释法[15]测定。

将生长至对数中期的肉汤在37℃下培养16小时，采用两倍稀释法将80μl的测试样品转移到试管中，使最终浓度分别为6400，3200，1600，800，400，200，100，50，25，12.5，6.25和0μg/ml，这就是以往装满1900μl的LB培养基。

细菌悬浮液（20μl）加到每个试管中形成单位为106（CFU）/ml的最终浓度。

将试管在37℃下放置24小时。

培养后，微生物的生长是通过估算浊度的增加来确定的，用UV-2100分光光度仪在630nm处测量MIC。

计算菌株的完全抑制的最高稀释度。

所有分析一式三份，并将各自的中值用于数据分析。

细菌膜通透性

嗜水气单胞菌TPS-30，生长至对数中期，在37℃培养16小时，并收集，洗涤，并重新悬浮于1ml的去离子水中（吸光度在630nm处调节至0.2）。

将大黄素样品溶液2试管（10μl）在37℃中放置任意时间。

然后，将细胞悬浮液以10000rpm离心10min，并且将上清液稀释至100倍[16]。

释放钾离子的量即由原子吸收光谱仪（美国Varian公司光谱学与机管局220）测定。

透射电子显微镜

指数细菌与2MIC大黄素在37℃下培养4小时后，通过离心收集，去离子水洗涤两次。

处理后，将细菌沉淀物固定，固定在2.5％的戊二醛缓冲液中1小时。

然后将细胞固定在1％的四氧化锇缓冲液中1h，用1％乙酸双氧铀将整块染色，脱水，分级乙醇浓度，并随后嵌入骨刺树脂。

所用的缓冲液为0.1M的二甲胂酸钠（pH7.4）。

制备聚乙烯醇缩甲醛的铜网切片，并用2％醋酸双氧铀和柠檬酸铅[17]染色。

青霉素作为阳性对照，和双蒸水作为阴性对照。

正常工作条件下，用透射电子显微镜（H-7000；

日本日立公司）进行观察。

流式细胞仪分析

大黄素治疗后膜的完整性是使用碘化丙啶的流式细胞术分析（PI）为探针[18]的。

嗜水TPS-30，生长至对数期和大黄素在2MIC的浓度混合4h，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）在37℃下洗涤细胞3次，并重新悬浮于106CFU/ml的缓冲液中。

37℃温度条件下，在大黄素处理过的细胞培养中的PI溶液（50μg/ml的终浓度）处理30min，随后多次用PBS洗涤除去未结合的染料。

PI是在488nm处使用氩激光，将得到的荧光发射通过一个660-nm的长通滤光器收集。

青霉素作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照。

使用FACScan仪器（刀魂，BO，USA）进行流式细胞分析。

荧光测量

大黄素在没有和嗜水基因结合时存在的荧光光谱测量，使用F-7000荧光光度计（日本日立公司），在室温下激发波长为290nm（KEX=290nm）。

从360至560nm的荧光光谱的变化，测定为增加浓度（0，5.0，10.0和20mg/mL），加入大黄素与固定浓度（200mg/mL）[19]的Tris-HCl缓冲液（10mM，pH7.2）的样品作为空白溶液，可用于所有样品。

有竞争力的大黄素约束力和EB细菌脱氧核糖核酸

竞争性结合的荧光测定，使用F-7000荧光光度计（日本日立公司）。

将DNA溶解于2ml的Tris-HCl缓冲液（10mM，pH7.2）中，将10μg/ml，10μlEB（2μM）溶液加入到DNA溶液后，在EB-DNA溶液置于37℃的恒温水中10分钟。

不同浓度的大黄素（0，50，100，和200μg/ml）加入到EB-DNA溶液，30分钟后，用荧光光谱测定各试验溶液，激发535nm处，记录从550到720nm的[20，21]光谱。

此试验是在一个1厘米长度的石英池中进行。

KI荧光猝灭

本实验是根据由郭某人[19]和宋某等[22]人描述的方法进行并稍做修改。

大黄素的浓度调整为200μg/ml；

碘化钾（KI）溶解在Tris-HCl缓冲液（10mM，pH7.2）中，最终至浓度为0，1，2，4，6，8，和10mmol的不同浓度。

然后将不同浓度的碘化钾加入含有或不含DNA（10μg/mL）的大黄素溶液中。

发射360至560nm的光谱并固定290nm激发波长。

数据绘制按照Stern-Volmer方程[23]F0/F=1+KSV[Q]；

其中F0和F分别是在荧光强度下DNA的不存在或存在，KSV是斯特恩—涹莫猝灭常数，[Q]是浓度的淬灭剂。

结果

大黄蒽醌类化合物的测定

大黄粗提取物的超高效液相色谱分析结果示于表1和图2。

从不同种植区采集的5种大黄蒽醌类化合物的总含量范围为5.87±

0.30至24.86±

0.81mg/g。

大黄的抗菌活性（MIC）与蒽醌含量相关（r=0.9306，P<

0.01）呈正相关。

表1不同种植地区的大黄抑菌活性及蒽醌含量（mg/g）之间的关系

结果表示为平均值±

标准差（n=3）。

株，嗜水TPS-30MIC最小抑制浓度

图2标准溶液（S）和样品1，2，3，4，5，6，7，8中大黄提取物的色谱图

a芦荟大黄素，b大黄酸，大黄素c，d大黄酚，e大黄素甲醚

蒽醌类化合物的抗菌活性

五种蒽醌类的抗菌活性（MIC）列于表2。

五种蒽醌对嗜水的MIC值介于50〜200μg/ml，其抗菌活性存在的一般顺序为：

大黄素=大黄酸=芦荟大黄素>

大黄素甲醚=大黄酚。

考虑到抗菌活性和大黄素的含量，大黄素被选为该类抗菌机理的候选蒽醌衍生物。

表2五种蒽醌对嗜水气单胞菌的抗菌活性

大黄素对嗜水细菌膜的透过性，通过大黄素处理后的细胞释放的钾离子的量的影响作为测定。

当细菌细胞膜被破坏，在一定程度上，小的离子，如钾和磷酸倾向于滤出，我们可以监测从细胞中释放的胞质成分。

图3显示了细菌细胞培养后钾流出，诱导后钾离子外流显著。

而增加孵育时间0.5〜4h，当时间进一步增加，对轻微的变化进行了观察。

为钾离子经过处理后释放量增加提供了证据，这就说明大黄素可能作用于细胞膜增加通透性，进而引起细胞离子泄漏。

图3大黄素对K离子嗜水TPS-30释放量的影响。

细胞用大黄素预定次数处理，测定细胞中K离子的释放相对量

在透射电子显微镜下观察，用大黄素处理过的细菌细胞的形态学变化。

电子显微照片见图4。

未经处理细菌的对照细胞保持完整，并呈现出光滑的表面（图4a）。

而且，培养4h后，该细胞表现出重要的形态变化，例如细胞壁和膜破坏，而且观察到细胞胞质内容物泄漏（图4b，c）中，它类似于在先前的研究[25]。

图4嗜水TPS-30大黄素处理（b）或青霉素（C，阳性对照），以及未处理的透射电子显微镜观测

（一）

调查大黄素的抗菌作用是否作用于损伤的质膜中，细胞与大黄素和PI。

PI是一种荧光染料，可嵌入到核酸的可行性标记，这是为了穿透细胞并污染其丧失完整性的膜[26]。

检测单个细胞内部的PI是通过流式细胞仪分析。

如图5，而