肿瘤细胞凋亡交流Word格式.docx

1、紫外光激发时发射敞亮的蓝色荧光。十、Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。 Hoechst 33258染色 1原理 33258和Hoechst 33342均为非嵌人性荧光染料。它们在活中 DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。活细胞或固定细胞都可从低浓度溶液中 摄取该染料。从而使细胞核着色。故又把此类染料称为DNA探针。Hoechst 33342和Hoechst 33258都可溶于水并在水溶液中维持稳固。Hoechsr-DNA的激发和发射波长别离550nm和460nm。在荧光显微镜紫外光激发时，H

2、oechst-DNA发出亮蓝色荧光。 2溶液的配制 （1）Hoechst 33258贮存液 Hoechst 33258 lmg 001molLPBS（pH 74） 5ml （2）Hoechst 33258工作液（终浓度为05ugml） Hoechst 33258浓缩液 125ul 001molLPBS（pH 74） 50ml 3操作程序 （1）细胞悬液或培育单层细胞等标本，用醋酸乙醇或Carnoy固定液固定； （2）001molLPBS漂洗5分钟； （3）Hoechst 33258工作液染色，室温15分钟； （4）001molLPBS漂洗3次，每次5分钟； （5）用甘油与PBS比例为1：9的混

3、合液或水溶性封片剂封片，荧光显微镜观看。 结果：该染料为的特异性荧光探针，细胞核呈亮蓝色荧光DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，利用终浓度一样为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图1）。3 透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavita

4、tions）的空泡结构（图2）；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体十一、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）十二、十三、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。 Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依托性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（propidine

5、 iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。方法1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（1106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反映5min后，加入400ul Binding Buffer，当即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一样不超过1h）， 同时以不加An

6、nexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2 贴壁培养的细胞染色：先用%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。结果 图4、图5注意事项1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。图4图5十四、线粒体膜势能的检测十五、线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细

7、胞凋亡不可逆转。十六、线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。十七、方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1m

8、M），TMRM（100nM），37C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。十八、注意事项十九、1 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。二十、2 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。二十一、DNA片断化检测二十二、细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50300kbp长的DNA大片段, 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染

9、色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。二十三、1. 大分子染色体DNA片段的测定二十四、细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为爬行。因此，细胞凋亡

10、早期产生的50300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。那个方式是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向从头定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时刻就越长。当DNA分子变换方向的时刻小于电脉冲周期时，DNA就能够够按其分子量大小分开。二十五、参考文献 Brown,., Sun, ., and Cohen, .（1993） Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to larg

11、e fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. . 268, 3037-3039二十六、2 DNA Ladder 测定二十七、方式：收成细胞（1107）沉淀?细胞裂解液?13000rpm5min, 搜集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56C，二十八、2h?蛋白酶K（ml）37C，2h?1/10体积3M醋酸钠和倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4C过夜?14000rpm15min?最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。二十九、结果：图6三十、参考文献

12、 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507三十一、3 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析三十二、方式：搜集细胞?70%冷乙醇（in PBS）4C固定留宿?PBS洗涤，1000rpm10min?RNase A（ml）37C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室温避光15min?FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的转变。三十三、

13、结果：图8三十四、4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay （CLONTECH）三十五、优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测8五 TUNEL法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nic

14、k end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。六、Caspase-3活性的检测 （1 2 3 三种方式同时利用仍是一种即可？）七、（Hoechst-PI 法在流式细胞仪上检测 VS Caspase 3 法在流式细胞仪两种方式的不同性）Caspase家族在介导细胞凋亡的进程中起着超级重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的初期时期，它被激活，活化的Caspase-3由两个大