肿瘤细胞凋亡交流Word格式.docx
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紫外光激发时发射敞亮的蓝色荧光。
十、 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释,终浓度为10ug/ml。
Hoechst33258染色
1.原理33258和Hoechst33342均为非嵌人性荧光染料。
它们在活中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。
活细胞或固定细胞都可从低浓度溶液中摄取该染料。
从而使细胞核着色。
故又把此类染料称为DNA探针。
Hoechst33342和Hoechst33258都可溶于水并在水溶液中维持稳固。
Hoechsr-DNA的激发和发射波长别离550nm和460nm。
在荧光显微镜紫外光激发时,Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。
2.溶液的配制
(1)Hoechst33258贮存液
Hoechst33258lmg
0.01mol/LPBS(pH7.4)5ml
(2)Hoechst33258工作液(终浓度为0.5ug/ml)
Hoechst33258浓缩液125ul
0.01mol/LPBS(pH7.4)50ml
3.操作程序
(1)细胞悬液或培育单层细胞等标本,用醋酸—乙醇或Carnoy固定液固定;
(2)0.01mol/LPBS漂洗5分钟;
(3)Hoechst33258工作液染色,室温15分钟;
(4)0.01mol/LPBS漂洗3次,每次5分钟;
(5)用甘油与PBS比例为1:
9的混合液或水溶性封片剂封片,荧光显微镜观看。
结果:
该染料为的特异性荧光探针,细胞核呈亮蓝色荧光
DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。
贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,利用终浓度一样为10ug/ml。
结果评判:
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:
Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;
Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;
Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。
3透射电子显微镜观察
凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期(pro-apoptosisnuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);
细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体
十一、磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnnexinV法)
十二、
十三、 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。
Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依托性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
方法
1悬浮细胞的染色:
将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(~1×
106)用PBS洗2次,加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室温避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反映5min后,加入400ulBindingBuffer,当即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一样不超过1h),同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2贴壁培养的细胞染色:
先用%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3爬片细胞染色:
同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
结果[图4、图5]
注意事项
1.整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。
2.操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。
图4--
图5--
十四、线粒体膜势能的检测
十五、 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位DYmt的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转。
十六、 线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
十七、 方法:
将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM),JC-1(1mM),TMRM(100nM),37°
C平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。
十八、 注意事项
十九、 1.始终保持平衡染液中pH值的一致性,因为pH值的变化将影响膜电位。
二十、 2.与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白,他们将与部分染料结合,降低染料的浓度,引起假去极化。
二十一、DNA片断化检测
二十二、 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。
细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。
如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNAladder的形成。
二十三、 1.大分子染色体DNA片段的测定
二十四、细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。
所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。
线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。
此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"
爬行"
。
因此,细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。
通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。
那个方式是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。
每当电场方向改变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向从头定向后,才能继续向前移动。
DNA分子量越大,这种重排所需要的时刻就越长。
当DNA分子变换方向的时刻小于电脉冲周期时,DNA就能够够按其分子量大小分开。
二十五、 参考文献Brown,.,Sun,.,andCohen,.(1993)Dexamethasone-inducedapoptosisinvolvescleavageofDNAtolargefragmentspriortointernucleosomalfragmentation.J..268,3037-3039
二十六、 2.DNALadder测定
二十七、 方式:
收成细胞(1′107)沉淀?
细胞裂解液?
13000rpm′5min,搜集上清?
1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°
C,
二十八、2h?
蛋白酶K(ml)37°
C,2h?
1/10体积3M醋酸钠和倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4°
C过夜?
14000rpm′15min?
最后将沉淀溶解在TEbuffer中,加DNALoadingBuffer?
%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。
二十九、 结果:
[图6]
三十、 参考文献HerrmannmM,LorenzHM,VollRetal.ARapidandsimplemethodfortheisolationofapoptoticDNAfragments.NucleicAcidRes.1994;
22:
5506-5507
三十一、 3.凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析
三十二、 方式:
搜集细胞?
70%冷乙醇(inPBS)4°
C固定留宿?
PBS洗涤,1000rpm′10min?
RNaseA(ml)37°
C消化30min?
PI(50mg/ml)染色,室温避光15min?
FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的转变。
三十三、 结果:
[图8]
三十四、 4.ApoAlertTMLM-PCRLadderAssay(CLONTECH)
三十五、优点:
敏感度高,适合于检测少量样本,小部分凋亡细胞。
如临床活组织检测
8--
五TUNEL法
细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'
-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'
-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL)。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'
-OH形成,很少能够被染色。
TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
六、Caspase-3活性的检测(123三种方式同时利用仍是一种即可?
?
)
七、 (Hoechst-PI法在流式细胞仪上检测VSCaspase3法在流式细胞仪两种方式的不同性)
Caspase家族在介导细胞凋亡的进程中起着超级重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的初期时期,它被激活,活化的Caspase-3由两个大