1、可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液的吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。三、材料、仪器设备及试剂(一) 材料:小麦或其它叶片(二)仪器设备:1. 研钵;2.紫外分光光度计;3. 离心机;4. 恒温水浴;5. 容量瓶。(三)试剂:1. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH2P04 8.5 ml);20.1 mol/LH2O2 (30%的H2O2溶液5.68ml
2、稀释至1000ml)二、 实验步骤:1、酶液提取 称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g,置于研钵中,加入23ml 4下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后,转入25ml 容量瓶中,并用缓冲液冲研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀,将容量瓶置5冰箱中静置10min,取上清液在4000r/min下离心15min,上清液即为过氧化氢粗提液,5下保存备用。2、测定 10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表1-1顺序加入试剂。25预热后,逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,260nm下测定吸光度,每隔1min读数1
3、次,共测4min,待3支管全部测完后,按式(1-1)计算酶活性。表1-1 紫外吸收法测H2O2样品测定液配制表管号S1S2S0空白粗酶液 (ml)0.40.4(失活酶液)0.4(磷酸缓冲液)PH7.8磷酸缓冲液(ml)3.0蒸馏水(ml)2.03、结果计算 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位()。过氧化氢酶活性(.g-1min-1)=A240*Vt/(0.1*Vl*t*FW) (1-1) 式中 A240 : As0-(As1+As2)/2;As0 :加入失活酶液的对照管吸光值;As1,As2 : 样品管吸光值;Vt :粗酶提取液总体积(ml);Vl :测定用粗酶提取液体积(ml);FW : 样品鲜重(g);0.1 : A240每下降0.1为1个酶活单位();t : 过氧化氢到最后一次读数时间(min)