电镜样品制备docWord格式.docx

1、此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台（粘胶）、导电处理等简单过程即可进行观察。如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求： 尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。 在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。 样品

2、表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。一般在810mm2左右，高度可达5mm。2. 扫描电镜要求完整且清洁表面，但是在许多样品的表面常附有粘液、血液、组织液及灰尘等杂物，妨碍着观察，以致造成对图像

3、的错误解释，所以，在固定前都必须特别做好表面的清洁工作。以下简介前期处理方法：清洁：对样品的清洁可根据不同的样品采用不同的方法，其中常用的方法有: 表面正常干燥的样品如叶、花瓣、茎等蜡叶标本，可用吹气球或用除尘器吹净，也可用软毛笔轻扫等方法除去表面的灰尘和其它杂物，但需注意不要损伤样品，吹风和清扫的力量取决于样品的硬度和污染的程度。 一般动植物组织，可用蒸馏水、生理盐水或缓冲液漂洗或冲洗。至于采用何种清洁液清洗，要视组织本身对清洗液渗透压变化的敏感程度而定，如用缓冲液清洗时，应与配制固定液的缓冲液一致，否则会因性质不同而产生化学反应从而影响固定效果。 对有油脂分泌物和蜡质覆盖层的样品如毛发、蚧

4、虫等，应采用有机溶剂反复浸洗。 对一些附有粘液的组织可采用酶解法或其它试剂处理来清洗，如一般组织可用木瓜蛋白酶和淀粉酶清洗；肠粘膜可用糜蛋白酶清洗；用胰蛋白酶可分离和清洗胃粘膜的细胞。有些组织也可用试剂进行清洗，如要分离神经细胞可用稀释的乙二胺四醋酸处理，用甘油和稀释的乙醇延长浸渍时间可以从分泌乳腺中除去乳汁等。 对微小的样品要用离心法或放在用镍过滤网制的小容器中清洗。 对于特殊的样品还须用特殊的方法进行清洗。固定: 样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样

5、品处理有不同之处。除采用戊二醛、四氧化锇、高锰酸钾等固定液进行固定外，还可采用下列几种固定液： Sjodstrand固定液： A液：氯化钠40.3g+氯化钾2.1g+钙0.9g+双蒸镏水500ml B液：醋酸钠9.714g+凡罗那钠（Veronal）14.74g+双蒸馏水500m1 使用时吸取A液10ml，B液3.4ml，再加0/1mol/L盐酸11ml和锇酸05g+50ml蒸馏水 Dalton氏固定液： 此种固定液为4重铬酸钾（pH7.2）与3.4氯化钠等量混和后，再与2四氧化锇等量混使即得。 这种固定液无沉渣，对样品损伤少。在能保持样品不变形的前提下，不少样品（特别是植物样品）采用戊二醛单

6、固定即可。为了加强固定效果，还可将几种不同的固定液配合使用，进行双固定或多次固定（尤其是动物样品）；如用用戊二醛作前固定，用锇酸作后固定。脱水：脱水剂常用乙醇和丙酮。丙酮能使組织块变硬，是它的优点。样品的干燥生物样品的制备中，干燥是最关键的步骤。干燥过程除引起样品收缩之外，水的表面张力会使样品表面形貌发生很大的变化，这对扫描电镜的表面形貌观察特别有害。在透射电镜的样品制备中用乙醇脱水，是为了包埋剂的渗透（因水不与包埋剂互溶，而乙醇则能互溶）。而在扫描电镜的样品制备中，脱水是用表面张力小的乙醇取代表面张力很大的水，从而使干燥过程对样品表面产生的影响较少。然后就是如何设法使样品表面不受或少受表面张

7、力影响的条件下除去乙醇，这就是干燥。目前常用的干燥方法主要有空气干燥法、临界点干燥法、冰冻干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等。空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。此法的最大优点是简单易行和节省时间，它的致命缺点是在干燥过程中，组织会因脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，此种方法一般只适用于外壳（表面）较为坚硬的样品。在采用空气干燥时，为了减少样品的收缩变形，除使用易挥发和表面张力小的脱水剂如乙醇、丙酮等外，还应使样品得到充分固定，特别是须经四氧化锇固定效果才较好。因为它会使组织变得较为坚硬，使收缩变形减少。然而，空气干燥引起

8、的收缩并非完全不利，有时可以通过收缩使细胞之间相互剥离，从而能清楚地观察到一个个单独存在的细胞及其表面结构。此外，还可通过细胞成份在干燥时的收缩，观察到细胞内的线粒体、细胞核等成份的存在。但这种机会很少，而且因收缩带来的不利是主要的，所以，目前很少采用。临界点干燥法临界点干燥法是一种消除了物相界面（液相气相），也就是消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所以样品不易收缩和损伤，此法所用的仪器结构不甚复杂，操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2h左右即可完成，所以，是最为常用的方法。物质的临界点是1822年由Charles cagridde La Tour发现的。他将

9、不同的液体分别装进玻璃试管并密封起来，然后一边转动一边加热，这时，他发现随着温度的升高，试管内的液相和气相之间的弯月面开始变得模糊起来，只有在试管冷却之后，弯月面才又重新出现。每种液体都存在某一温度，在这一温度时，液相的弯月面完全消失。那么，弯月面的消失意味着什么呢?它意味着液相和气相之间的界面没有了，之所以出现这种现象，是因为在密封的容器里，液体受热膨胀，而气体本身被压缩，最后在某一特定的温度和压力下，液体由于膨胀，气体由于被压缩而使两者的密度相同，因而相互混合成一种均一的流体，原先存在它们之间的弯月面（即液面）就消失了，表面张力也自然消失了。因此，所谓临界点，就是指使物质的气态和液态两相之

10、间达到相同密度，成为均一流体状态时的温度和压力的总称。此时的温度称临界温度；此时的压力称临界压力。不同的物质都有其特定的临界点，一般用于扫描电镜样品临界点干燥的置换剂的临界温度和压力见表10-1。如果在临介点进行干燥，由于表面张力消失就不会造成样品表面的损伤。但进行临界点干燥，需用专用的临界点干燥器。具体处理步骤如下：1. 固定脱水 按透射电镜常规制样方法进行。2. 纯丙酮置换乙醇 如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100后，用纯丙酮置换1520min。3. 中间液处理 即在用丙酮置换乙醇后,用醋酸异戊酯（乙酸异戊B8）处理15-80min（也可以过夜）置换丙酶。由于醋酸异戊酯与液态二氧化碳能互溶

11、，使液态二氧化碳容易渗入样品中。4. 装样 将样品从醋酸异戊酯中挑入（或倒入）样品笼中，用滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的样品杯（高压容器）内，盖上盖并拧紧以防漏气。（注：在装样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0处预冷1015min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中）。5. 注入液体二氧化碳 依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的进气阀在010下，向样品杯注入液体二氧化碳。6. 漂洗 当液体二氧化碳充至样品杯容积的50（通过刻度尺观察，以液面超过样品笼为度）时，关闭仪器进气阀，静置1520min，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后，打开仪器排气流量计阀门和进气

12、阀门，让其边排气边充液10min左右，（让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出和充入新鲜的液态二氧化碳）再关闭排气阀；继续充入液体二氧化碳至样品杯的80左右，关闭进液阀，停止充液。7. 加温置换 将温度调节设定在20处经1520min后，由于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧化碳充分置换。8. 气化 将温度旋钮调至临界温度以上（3540），此时随着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳的临介点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时，经5min后，即可排气。9. 排气 在保持温度不变的条件下（即不关电源），打开流量计的排气

13、阀门，以1.01.51min的速度排气（速度慢些更好）。约经4560min后，排气完毕，样品杯的压力下降到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀膜（若不能立即装台，应置于干燥器内保存）。临界点干燥的成败如何；与每一步的操作有很大关系，因此，操作时应注意以下事项：1. 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至010，因为温度过高，充入的液体二氧化碳会立即气化膨胀，压力增加，妨碍二氧化碳液体继续进入样品杯。2. 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干燥而造成样品己变形，再进

14、行临介点干燥也没有意义了。3. 一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而达不到临界点。4. 充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容积的2/3左右。5. 在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临界状态。6. 开、闭阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在4Omin以上，有时也可以放气过夜或过中午。二氧化碳临界点干燥法除用液体二氧化碳外，也有用固体二氧化碳（干冰）作干燥介质的。与液体二氧化碳比较，固体二氧化碳有以下优点:1. 有利于微小样品的干燥，例如像玻璃片上的游离细胞，若用液体二氧化碳干燥，由于二氧化碳气体急剧地喷入样品杯内很可能使样品被吹掉，而用固体二氧化碳干燥，则完全没有这种危险。2. 不需要用钢瓶，钢瓶很重，搬运麻烦；用固体二氧化碳时，有适当大小的保温瓶（如冰壶）就可以了，因此很方便。3. 能保证二氧化碳装满样品室，即使用固体二氧化碳时，每次都能准确地放入足够酌量，而不会像使用液体二氧化碳时由于钢瓶中二氧化碳不足，充不进样品杯内，使样品干燥不完全而造成损伤。4. 夏天使用方便 在使用液体二氧化碳时，若室温超过临界温