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实验一 光学显微镜的使用与微生物观察Word格式文档下载.docx

1、它是一个用于安装物镜的圆盘,位于镜筒下端,其上装有35个不同放大倍数的物镜。为了使用方便,物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时,必须用手旋转圆盘,切勿用手推动物镜,以免松脱物镜而招致损坏。(5)载物台:载物台又称镜台,是放置标本的地方,呈方形或圆形。载物台上装有压片夹,可以固定被检标本;有标本移动器,转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺,可指示标本的位置,便于重复观察。(6)调节器:调节器又称调焦装置,由粗调螺旋和细调螺旋组成,用于调节物镜与标本间的距离,使物像更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm,细调螺旋转动一圈可使镜

2、筒升降约0.1mm。图1-1 普通光学显微镜的构造1. 镜座2. 镜臂3. 镜筒4. 转换器 5. 载物台 6. 压片夹 7. 标本移动器8. 粗调螺旋9. 细调螺旋 10. 目镜 11. 物镜 12. 虹彩光阑(光圈)13. 聚光器14. 反光镜2、光学系统光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。(1)目镜:它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜,下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小,故它又称为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之内,在光阑上粘一小段细发可用作指针,指示视野中标本的位置。在进行显微测量时,

3、目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上刻有5、10、15、20等放大倍数。可按需选用。(2)物镜:它的功能是把标本放大,产生物像。物镜可分为低倍镜(4或10)、中倍镜(20)、高倍镜(4060)和油镜(100)。一般油镜上刻有“OI”(oil immersion)或HI(homogeneous immersion)字样,有时刻有一圈红线或黑线,以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径(numerical aperture,简写为NA)、工作距离(物镜下端至盖玻片间的距离,mm)及盖玻片厚度等参数(图1-2)。以油镜为例,100/1.25分别表示放大倍数为100倍,NA为1.25;160/0.1

4、7分别表示镜筒长度160mm,盖玻片厚度等于或小于0.17mm。图1-2 XSP-I6型显微镜物镜的主要参数(3)聚光器:聚光器又称聚光镜,它的功能是把平行的光线聚焦于标本上,增强照明度。聚光器安装在镜台下,可上下移动。使用低倍物镜(简称低倍镜)时应降低聚光器,使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑(俗称光圈),通过调整光阑孔径的大小,可以调节进入物镜光线的强弱(物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3)。在观察透明标本时,光圈宜调得相对小一些,这样虽会降低分辨力,但可增强反差,便于看清标本。图1-3 物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系(4)反光镜:它是普通光学显微镜的取光

5、设备,其功能是采集光线,并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座上,可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜,另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜,光量不足时可换用凹面镜。(二)普通光学显微镜的性能1、数值孔径数值孔径(NA)又称开口率,是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积,可用式1-1表示。(1-1)式中,n为物镜与标本之间介质的折射率, 为镜口角(通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角(图1-4)。物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关,数值孔径越大,物镜的性能越好。因为镜口角 总是小于180,所以sin的最大值不可能超过1。又因为空气的折射率为1,所以以空气为介质

6、的数值孔径不可能大于1,一般为0.050.95。根据式1-1,要提高数值孔径,一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率(图1-5)。使用香柏油(折射率为1.515)浸没物镜(即油镜)理论上可将数值孔径提高至1.5左右;实际数值孔径值也可达1.21.4。 图1-4 物镜的镜口角 图1-5 介质折射率对光线通路的影响2、分辨率分辨率是指分辨物像细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离(D)来表征(式1-2)。D值愈小,分辨率愈高。(1-2)式中,为光波波长。比较式1-1和式1-2可知,D可表示为:(1-3)根据式1-3,在物镜数值孔径不变的条件下,D值的大小与光波波长成正比。

7、要提高物镜的分辨率,可通过两条途径: 采用短波光源。普通光学显微镜所用的照明光源为可见光,其波长范围为400700nm。缩短照明光源的波长可以降低D值,提高物镜分辨率。加大物镜数值孔径。提高镜口角 或提高介质折射率n,都能提高物镜分辨率。若用可见光作为光源(平均波长为550 nm),并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本,能分辨出的两点距离约为0.22m。3、放大率普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像,故又被称为复式显微镜。采用普通光学显微镜观察标本时,标本先被物镜第一次放大,再被目镜第二次放大(图1-6)。所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。因此,显微镜的放大率(V)是物镜放

8、大倍数(V1)和目镜放大倍数(V2)的乘积,即:V=V1V2(1-4)如果物镜放大40倍,目镜放大10倍,则显微镜的放大率是400倍。常见物镜(油镜)的最高放大倍数为100倍,目镜的最高放大倍数为15倍,因此一般显微镜的最高放大率是1500倍。图1-6 普通光学显微镜的成像原理4、焦深一般将焦点所处的像面称为焦平面。在显微镜下观察标本时,焦平面上的物像比较清晰,但除了能看见焦平面上的物像外,还能看见焦平面上面和下面的物像,这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比,数值孔径和放大率越大,焦深越小。因此,在使用油镜时需要细心调节,否则物像极易从视野中滑过而不能找到。三、实验器

9、材1、 仪器 显微镜;2、 材料 ?标本片,香柏油,二甲苯,擦镜纸。四、实验程序(一)显微镜(油镜)操作1、领取并检查显微镜:按学号向实验指导老师领取显微镜,所有实验课均对号使用。从显微镜箱中取出显微镜时,用右手紧握镜臂,左手托住镜座,直立平移(图1-7),轻轻放置在实验台上(图1-8),检查各部件是否齐全,镜头是否清洁,有问题及时报告老师。图1-7 显微镜的搬动图1-8 显微镜的放置光源:良好的照明是保证显微镜使用效果的重要条件。将低倍镜旋转到工作位置,用粗调螺旋提升镜筒,使镜头距离载物台10mm左右,降低聚光镜的位置,完全打开虹彩光阑,一边看目镜,一边调节反光镜镜面的角度(在正常情况下,一

10、般用平面反光镜;若自然光线较弱,则可用凹面反光镜)。然后,调节聚光器的位置(酌予升降),直至视野内得到均匀适宜的亮度。3、低倍镜观察:使用低倍镜观察,视野较广,焦深较大,便于搜寻目标,因此宜从低倍镜开始观察。将载玻片标本(涂面朝上)置于载物台中央(图1-9),用压片夹固定(图1-10),并将标本部位移到正中,转动粗调螺旋(图1-11),使镜头与标本的距离降到10mm左右。然后,一边看目镜内的视野,一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头,至视野内出现物像时,改用细调螺旋(图1-12),继续调节焦距和照明,以获得清晰的物像,并将所需部位移到视野中央,再换中、高倍镜观察(图1-13)。图1-9 将载玻片标本置

11、于载物台中央 图1-10 用压片夹固定载玻片标本图1-11 转动粗调螺旋 图1-12 转动细调螺旋 图1-13 转换物镜4、中、高倍镜观察:依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位,并随着物镜放大倍数的增加,逐步提升聚光器增强光线亮度。找出所需目标,将其移至视野中央。5、油镜观察:将聚光器提升至最高点,转动转换器,移开高倍镜,使高倍镜和油镜成“八”字形,在标本中央滴一小滴香柏油,把油镜镜头浸入香柏油中,微微转动细调螺旋,直至看清物像。如果油镜上升至离开油面还未看清物像,则需重新调节。可从侧面注视,小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中,但不能让油镜压在标本上,更不能用力过猛,击碎玻片,损坏镜头

12、。6、调换标本:观察新标本片时,必须重新从第3步开始操作。7、用后复原:观察完毕,转动粗调螺旋提升镜筒,取下载玻片,先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油,然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯(香柏油可溶于二甲苯)擦去镜头上的残留油迹,再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯,最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。降低镜筒,将物镜转成“八”字形置于载物台上。降低聚光器,避免聚光器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座,以防受损。将显微镜放回显微镜箱中锁好,并放入指定的显微镜柜内。第二节 微生物形态观察一、仪器和材料1、 显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。2、 示范片:大肠杆菌(杆状)、小球菌(球状)、硫酸盐还原菌

13、(弧形)、枯草芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等。二、试验内容和操作方法1、 严格按照光学显微镜操作方法,依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、弧状和丝状的细菌示范片,用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。2、 同法逐个观察放线菌的示范片,分别绘出其形态图。3、 同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片,分别绘出其形态图。问题与思考1、使用显微镜的油镜时,为什么必须使用镜头油?2、镜检标本时,为什么先用低倍镜观察,而不直接用高倍镜或油镜观察?实验二 培养基的配制一、实验目的 1. 学习制备培养基的基本技术。2. 制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。二、实验基本原理培养基是将微 生物生长繁殖所需要的各种

14、营养物质,用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件;(1)适当组分和比例的营养物质;(2)适宜的pH值;(3)合适的渗透压;(4)保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。培养基的种类:根据培养基的组成成分,可将培养基分为三类:合成培养基:由各种纯化学物质按一定比例配制而成。半合成培养基:由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。天然培养基:利用天然来源的有机物配制而成的。从培养基的物理状态来分:液体培养基:不加凝固剂的液态状培养基。固体培养基:在液体培养基中加入2左右的凝固剂的固体状

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