实验一 光学显微镜的使用与微生物观察Word格式文档下载.docx

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它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。

为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。

转动物镜转换器可以选用合适的物镜。

转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。

（5）载物台：

载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。

载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；

有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。

有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。

（6）调节器：

调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。

粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。

图1-1 

普通光学显微镜的构造

1.镜座 

2.镜臂 

3.镜筒 

4.转换器 

5.载物台 

6.压片夹7.标本移动器 

8.粗调螺旋 

9.细调螺旋 

10.目镜11.物镜 

12.虹彩光阑（光圈） 

13.聚光器 

14.反光镜

2、光学系统

光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。

（1）目镜：

它的功能是把物镜放大的物像再次放大。

目镜一般由两块透镜组成。

上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。

在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。

由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。

标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指针，指示视野中标本的位置。

在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。

目镜上刻有5×

、10×

、15×

、20×

等放大倍数。

可按需选用。

（2）物镜：

它的功能是把标本放大，产生物像。

物镜可分为低倍镜（4或10×

）、中倍镜（20×

）、高倍镜（40～60×

）和油镜（100×

）。

一般油镜上刻有“OI”（oilimmersion）或HI（homogeneousimmersion）字样，有时刻有一圈红线或黑线，以示区别。

物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numericalaperture，简写为NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数（图1-2）。

以油镜为例，100/1.25分别表示放大倍数为100倍，NA为1.25；

160/0.17分别表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。

图1-2 

XSP-I6型显微镜物镜的主要参数

（3）聚光器：

聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。

聚光器安装在镜台下，可上下移动。

使用低倍物镜（简称低倍镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。

聚光器上附有虹彩光阑（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3）。

在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反差，便于看清标本。

图1-3 

物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系

（4）反光镜：

它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。

反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。

反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。

一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。

（二）普通光学显微镜的性能

1、数值孔径

数值孔径（NA）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可用式1-1表示。

（1-1）

式中，n为物镜与标本之间介质的折射率，为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角（图1-4）。

物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔径越大，物镜的性能越好。

因为镜口角总是小于180˚，所以sin

的最大值不可能超过1。

又因为空气的折射率为1，所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05～0.95。

根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率（图1-5）。

使用香柏油（折射率为1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至1.5左右；

实际数值孔径值也可达1.2～1.4。

图1-4 

物镜的镜口角 

　　图1-5介质折射率对光线通路的影响

2、分辨率

分辨率是指分辨物像细微结构的能力。

分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离（D）来表征（式1-2）。

D值愈小，分辨率愈高。

（1-2）

式中，λ为光波波长。

比较式1-1和式1-2可知，D可表示为：

（1-3）

根据式1-3，在物镜数值孔径不变的条件下，D值的大小与光波波长成正比。

要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：

①采用短波光源。

普通光学显微镜所用的照明光源为可见光，其波长范围为400～700nm。

缩短照明光源的波长可以降低D值，提高物镜分辨率。

②加大物镜数值孔径。

提高镜口角或提高介质折射率n，都能提高物镜分辨率。

若用可见光作为光源（平均波长为550nm），并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本，能分辨出的两点距离约为0.22μm。

3、放大率

普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像，故又被称为复式显微镜。

采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大（图1-6）。

所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。

因此，显微镜的放大率（V）是物镜放大倍数（V1）和目镜放大倍数（V2）的乘积，即：

V=V1×

V2 

（1-4）

如果物镜放大40倍，目镜放大10倍，则显微镜的放大率是400倍。

常见物镜（油镜）的最高放大倍数为100倍，目镜的最高放大倍数为15倍，因此一般显微镜的最高放大率是1500倍。

图1-6普通光学显微镜的成像原理

4、焦深

一般将焦点所处的像面称为焦平面。

在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。

物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比，数值孔径和放大率越大，焦深越小。

因此，在使用油镜时需要细心调节，否则物像极易从视野中滑过而不能找到。

三、实验器材

1、仪器显微镜；

2、材料？

标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。

四、实验程序

（一）显微镜（油镜）操作

1、领取并检查显微镜：

按学号向实验指导老师领取显微镜，所有实验课均对号使用。

从显微镜箱中取出显微镜时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，直立平移（图1-7），轻轻放置在实验台上（图1-8），检查各部件是否齐全，镜头是否清洁，有问题及时报告老师。

图1-7显微镜的搬动 

　　　图1-8显微镜的放置

光源：

良好的照明是保证显微镜使用效果的重要条件。

将低倍镜旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台10mm左右，降低聚光镜的位置，完全打开虹彩光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面的角度（在正常情况下，一般用平面反光镜；

若自然光线较弱，则可用凹面反光镜）。

然后，调节聚光器的位置（酌予升降），直至视野内得到均匀适宜的亮度。

3、低倍镜观察：

使用低倍镜观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。

将载玻片标本（涂面朝上）置于载物台中央（图1-9），用压片夹固定（图1-10），并将标本部位移到正中，转动粗调螺旋（图1-11），使镜头与标本的距离降到10mm左右。

然后，一边看目镜内的视野，一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现物像时，改用细调螺旋（图1-12），继续调节焦距和照明，以获得清晰的物像，并将所需部位移到视野中央，再换中、高倍镜观察（图1-13）。

图1-9将载玻片标本置于载物台中央 

图1-10用压片夹固定载玻片标本

图1-11转动粗调螺旋 

图1-12转动细调螺旋 

图1-13转换物镜

4、中、高倍镜观察：

依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着物镜放大倍数的增加，逐步提升聚光器增强光线亮度。

找出所需目标，将其移至视野中央。

5、油镜观察：

将聚光器提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调螺旋，直至看清物像。

如果油镜上升至离开油面还未看清物像，则需重新调节。

可从侧面注视，小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中，但不能让油镜压在标本上，更不能用力过猛，击碎玻片，损坏镜头。

6、调换标本：

观察新标本片时，必须重新从第3步开始操作。

7、用后复原：

观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯（香柏油可溶于二甲苯）擦去镜头上的残留油迹，再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯，最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。

降低镜筒，将物镜转成“八”字形置于载物台上。

降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。

使反光镜垂直于镜座，以防受损。

将显微镜放回显微镜箱中锁好，并放入指定的显微镜柜内。

第二节微生物形态观察

一、仪器和材料

1、显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。

2、示范片：

大肠杆菌（杆状）、小球菌（球状）、硫酸盐还原菌（弧形）、枯草芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等。

二、试验内容和操作方法

1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、弧状和丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。

2、同法逐个观察放线菌的示范片，分别绘出其形态图。

3、同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片，分别绘出其形态图。

问题与思考

1、使用显微镜的油镜时，为什么必须使用镜头油？

2、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不直接用高倍镜或油镜观察？

实验二培养基的配制

一、实验目的

1.学习制备培养基的基本技术。

2.制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。

二、实验基本原理

培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。

培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。

它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；

（1）适当组分和比例的营养物质；

（2）适宜的pH值；

（3）合适的渗透压；

（4）保持无菌状态。

所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。

培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。

培养基的种类：

根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：

合成培养基：

由各种纯化学物质按一定比例配制而成。

半合成培养基：

由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。

天然培养基：

利用天然来源的有机物配制而成的。

从培养基的物理状态来分：

液体培养基：

不加凝固剂的液态状培养基。

固体培养基：

在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状