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1、论文目 录摘要3关键词31 银翘片的介绍4 2 维生素C的介绍 42.1 简单介绍42.2 理化性质43 实验方法 43.1 碘量法 43.2 维生素C的高效液相色谱法定量测定63.3 荧光法113.4 4-二硝基苯肼法 133.5 2，6-二氯靛酚滴定法15参考文献17 摘要：分析了银翘片中的维生素C含量的测定，对银翘片和维生素C的介绍及根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。主要用的测定方法有：碘量法；高效液相色谱法；荧光法；2，4-二硝基苯肼法（总VC）和2，6-二氯靛酚法（还原型VC）关键词：银翘片 维生素C 碘量法 高效液相色谱法 荧光法1 银翘片的介绍主要成分金银花、连翘、荆芥

2、、淡牛股、牛蒡子、桔梗、薄荷油、芦根、淡竹叶、维生素C、马来酸氯苯那敏、对乙酰基酚等13味、辅料为淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、食用色素。性 状本品为糖衣片，除去糖衣后显灰褐色，略带有少许白色斑点，或显灰褐色与白色或淡黄色层；气微，味微苦。功能主治辛凉解表，清热解毒。用于流行性感冒引起的发热头痛，咳嗽，口干，咽喉疼痛。2 维生素C的介绍2.1 简单介绍维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗

3、氧化剂。维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190192，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。2.2 理化性质本品为白色结晶或结晶粉末；无臭，味酸；久置色渐变微黄。在水中易溶，水溶液呈酸性，在乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中部溶。分子中有两个手性碳原子，因而具有旋光性。与糖的结构相似，具有糖类性质的反应结构中的烯二醇具有极强的还原性，易被氧化为去氢维生素，氢化又可还原为维生素C。维生素C分子中具有烯二醇结构，故维生素C显酸性，能与碳酸氢

4、钠作用生成钠盐维生素C分子结构具有共轭双键，在稀盐酸溶液中，243nm波长处有最大吸收；若在中性或碱性条件下，则波长红移至265nm3 实验方法根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有：碘量法；高效液相色谱法；荧光法；2，4-二硝基苯肼法（总VC）和2，6-二氯靛酚法（还原型VC）3.1 碘量法3.1.1 试验目的(1) 掌握碘标准溶液的配制与标定(2) 熟悉直接碘量法的原理(3) 学习维生素C的含量测定方法3.1.2 试验原理Gr2O72- + 6 I- + 14 H+ 2 Gr3+ + 3 I2 + 7H2O I2 + 2S2O32- 2I- + S4O62- C(K2

5、Gr2O7)V(K2Gr2O7)C(Na2S2O3)=-6 V(Na2S2O3) C6H8O6 +I2 C6H6O6 + 2HI C(I2)V(I2)M(C6H8O)W(C6H8O6) = -100% M(试样)3.1.3 仪器和试剂仪器：棕色试剂瓶 (500ml) 分析天平、吸滤瓶、量筒（50ml.100ml）、碘量瓶（250ml）、试剂瓶（500 ml）、锥形瓶（250ml）、烧杯（500ml）、砂芯漏斗、酸式滴定管（50ml）、移液管(25.00ml)台秤及研钵、棕色容量瓶（1000ml）等试剂：碘（A.R.）、维生素C片剂、0.5%淀粉指示剂、Na2S2O35H2O、Na2CO3 、K

6、2Gr2O7（120烘干）、HCl(mol)、KI(20)溶液、碘化钾（A.R.）、HAC（2mol/l）、硫代硫酸钠 (0.1mol/l)、HAC（2mol/l）等3.1.4 实验步骤(1) 0.05MOL/L碘标准溶液的配制称取6.6g和10gKI置于玻璃研钵中，加少量水研磨，待碘全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶中，加两滴浓盐酸，用蒸馏水稀释至500ml,摇匀，用砂芯漏斗过滤后，置于阴暗处保存(2) 碘溶液的标定准确称取25.00ml碘溶于250ml锥形瓶中加入50ml蒸馏水，用前一试验已标定过的0.1mol/LNa2S2O4 标准溶液滴定至浅黄色，加入2ml淀粉指示剂继续滴定至溶液的蓝色

7、恰好消失，即为终点，平行标定3次，记录消耗的Na2S2O4 标准溶液的体积，计算I2 标准溶液的浓度。表3-1 Na2S2O4标准溶液的配制与标定 试样/数据处理（1）（2）（3）称样前m(K2Gr2O7)g22.184022.184022.1840称样后m(K2Gr2O7)g20.190122.190122.1901m(K2Gr2O7)g1.99391.99391.9939V（Na2S2O4）/（mL）38.0137.9838.01C（Na2S2O4/（mol/L）0.10700.10710.1070平均浓度0.1070Rd0.0312表3-2 0.1mol/L I2标准溶液的配制与标定试样

8、/数据处理称m(I2+KI)g12.8000平均C（Na2S2O4）/（mol/L）0.1070V（Na2S2O4）/（mL）25.0025.0025.00V（I2）/（mL）13.0613.0213.05C（I2）/mol0.10240.10270.1025平均浓度0.1025Rd0.0976(3) 维生素C含量的测定 准确称取0.2g研碎的维生素C于250ml锥形瓶中，加入100ml新煮沸过的冷蒸馏水，2MOL/LHAC溶液10ml使之溶解，加入2ml淀粉指示剂，立即用I2 标准溶液地至溶液呈蓝色并保持0.5min不退色，即为终点。平行滴定3次，记录I2 标准溶液的用量，计算维生素C的含量

9、。表3-3 VC药中VC含量的测定试样/数据处理称m(VC药片)0.0750平均C（I2）/mol0.1025V（I2）/（mL）W（C6H8O6）平均W（C6H8O6）Rd3.2 维生素C 的高效液相色谱法定量测定3.2.1 所用仪器和试剂：（1）仪器：Agilent 1100安捷伦高效液相色谱仪，二极管阵列检测器；高压输液泵 均为(美国惠普公司)；色谱柱 HYPERSIL - C18 (5m, 150 mm *4.6 mm) (中国科学院兰州化学物理研究所)；KQ5200B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ；平头微量进样器（25uL）；AE系列电子天平(精确度为0.00001)

10、(梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司)；SQ2119N多功能食品榨汁机 (上海帅佳电子科技有限公司)。（2）试剂:维生素C标准对照品 (维生素C含量99.7% ,中国医药集团化学试剂公司制)； 草酸 (分析纯, 中国医药集团化学试剂有限公司)； 福建蜜柚(市售)；三次蒸馏水；甲醇（色谱纯，上海化学试剂研究所）；无水磷酸二氢钾 （分析纯，上海实意化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（分析纯，中国医药集团化学试剂有限公司）。3.2.2 样品处理及实验条件取本品研磨均匀的细粉适量（约相当于维生素C22.5mg），置50ml量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20

11、l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素C对照品同法测定，用峰面积以外标法计算，即得。维生素C标准溶液的制备:准确称取维生素C标准品50 mg于小烧杯中，用0.1%草酸溶液溶解,转移至50mL棕色容量瓶中，稀释至刻度,得到维生素C含量为1000 g/mL的标准溶液。HPLC检测条件: A: pH 6.0，0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液, B:甲醇;（A:B=80:20V/V）为流动相溶液11-12，流速1.0 mL/min；检测波长254 nm，进样量10L，柱箱温度25。3.2.3 结果与讨论(1) 维生素C 检测波长的选择 维生素C溶液在254nm 有最大吸收，故本实验以254nm 作

12、为检测波长。(2) 样品溶剂的选择液体维生素C具有较强的还原性,易受空气、热、光等因素影响,但在酸性溶液中却很稳定. 为防止样品及标样中维生素C被氧化分解8，用0.1%草酸溶液作溶剂来溶解样品及标样。(3) 流动相的选择流动相pH值的选择：考虑到维生素C在酸性环境中比较稳定，所以选择调整流动相PH值为酸性。经过采用不同值的实验证明，pH值在5.0-6.5之间，维生素C的吸收比较大，灵敏度比较高，最终选择pH为6.011-12。流动相的配比选择：经实验：pH 6.0, 0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与甲醇配比从85：15；80：20 ；75：25；70：30；但80：20 峰形较好，考虑到了

13、出峰快了杂质干扰较大，出峰慢了，实验时间变长，最后确定 了80：20的配比9。(4) 标准工作曲线绘制用0.1%草酸溶液分别配制浓度20mg.L-1，40mg.L-1，60mg.L-1，80mg.L-1，100mg.L-1维生素C标准溶液,定容至50mL，溶液用0.45m 虑膜（水型）过滤后用微量进样器（25L）进样10uL.测定出维生素C标准溶液浓度对应的峰面积；然后以VC标准溶液浓度（mg/L）作自变量，相对应的峰面积作因变量；绘制标准工作曲线见图3-1图3-1 维生素C的标准工作曲线(5) 回收率实验在测定完蜜柚样品溶液中的维生素C含量后，分别取样品5mL,再在样品中加入浓度为100g/

14、mL的维生素标准溶液，定容至25mL，进行峰面积的测定，然后将得到的峰面积代入线性回就可以得到一个相应的Vc 测量值, 经计算即可得到VC的回收率。具体加收率试验结果见表3-4表3-4 回收率实验结果编 号 样品中维生素C量/g加入维生素C标准样 品 量/g测得的维生素C量/g回收率/%1194.25100271.8692.392194.25200378.2495.943194.25300531.32107.504194.25400630.38106.085194.25500664.1995.67(6) 精密度实验同一蜜柚样品在同一实验条件下测定8次,实验结果见表3-5.标准样品色谱图见图3-

15、2，蜜柚色谱图见图3-3， 其1.580 min峰为标准样品维生素C色谱峰，1.589 min峰为蜜柚样品维生素C色谱峰。表3-5 精密度实验结果( n = 8)维生素C测定结果mg/100mL平均值mg/100mL标准偏差相对标准偏差/%38.97,38.9538.42,38.4438.88,39.7739.07,38.3338.850.46961.21图3-2 标准样品色谱图图3-3 蜜柚样品色谱图3.2.4 结论由于维生素C对光不稳定，遇氧易分解，故本实验应避光操作，整个实验均用棕色容量瓶定容13；流动相均需色谱纯度，水用高纯度水，脱气后的流动相要小心尽量不引起气泡；所有过柱子的液体均需

16、严格的过滤；压力不能太大，最好不要超过150Bar。由图3-1可知,其标准工作曲线的相关系数R2为0.9994， 说明曲线的线性关系较好,分析中受样品中其他杂质的影响较小。 从表3-4中可以看到,本文采用A：pH 6.0，0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液；B:：甲醇，（A:B=80：20V/V）作流动相的高效液相色谱法，测定蜜柚中维生素C的含量,回收率为92.4107.5% ，说明该方法具有所需试剂少、稳定、操作简便等特点。从表3-5中可以得到：精密度实验的相对标准偏差小于2% ，说明该方法重复性和再现性都是比较高的。 而且从蜜柚样品色谱图中看到，该方法分析维生素C的含量大约需要2 min，

17、具有灵敏、快速的特点. 由以上分析可知：本文采用的分析方法是可靠的，它也适合于从其它蔬菜、水果中提取维生素C的测定4 8 。3.3 荧光法3.3.1原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022g/ml。3.3.2 适用范围GB12392-90本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定3.3.3 仪

18、器(1) 实验室常用设备。(2) 荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。(3) 打碎机。3.3.4 试剂本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。(1) 偏磷酸乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4冰箱可保存710天。(2) 0.15mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。(3) 偏磷酸乙酸硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。(4) 50乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa3H2O），加水至1000ml。(5) 硼酸-乙酸钠溶液

19、：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。临用前配制。(6) 邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。(7) 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。变色范围：pH=1.2红色pH=2.8黄色pH4.0兰色(8) 活性炭的活化：加200g炭粉于1L1+9盐酸中，加热回流12h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110120烘箱中干燥，备用。(9) 标准抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.

20、1）溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。抗坏血酸标准使用液（100g/ml）：取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH2.2时，则应用溶液（4.3）稀释。标准曲线的制备：取下述标准溶液（抗坏血酸含量10g/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。3.3.5 操作步骤(1) 样品制备全部实验过程应避光。称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释

21、，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40100g/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。(2) 氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。(3) 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明标准及标准空白。(4) 各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明样品及样品空白。(5) 于标准空白及样品空白溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至

22、50ml，在4冰箱中放置2h，取出备用。(6) 于样品及标准溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。(7) 荧光反应取标准空白溶液，样品空白溶液及（5.6）中样品溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。3.3.6 计算X=（cV/m）F(100/1000)式中：X-样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/1

23、00g；c-由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，g/ml；m-试样质量，g；F-样品溶液的稀释倍数；V-荧光反应所用试样体积，ml。例：测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每ml含2.5g、5.0g、7.5g及10.0g，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（g/ml），按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。如：取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光

24、标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23g。 23100 50 100 - -= 52（mg/100g） 2.138 10 10003.3.7 注意事项(1) 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。(2) 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。(3) 活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。3.4

25、4-二硝基苯肼法3.4.1 原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。3.4.2 适用范围GB12392-90本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。3.4.3 仪器(1) 恒温箱：370.5(2) 可见-紫外分光光度计(3) 打碎机3.4.4 试剂本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。(1) 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml。(2) 85%硫酸：谨慎地加900ml硫酸（

26、比重1.84）于100ml水中。(3) 2%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。(4) 2%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1000ml。(5) 1%草酸溶液：稀释500ml2%草酸溶液到1000ml。(6) 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml1%草酸溶液中。(7) 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。(8) 1mol/L盐酸：取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml。(9) 活性炭：将100g活性炭加到750ml1mol/L盐酸中，回流12h，过滤，用水

27、洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110烘箱中烘干。(10) 标准 抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml1%草酸溶液中。 标准曲线绘制加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为20g/ml。取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10及12g/ml。按样品测定步骤形成脎并比色。以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（g/ml

28、）为横坐标绘制标准曲线。3.4.5 操作步骤(1) 样品制备全部实验过程应避光。 鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。(2) 氧化处理：取25ml上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml此氧化提取液，加入10ml2%硫脲溶液，混匀。(3) 呈色反应 于三个试管中各加入4ml稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入370.5恒温箱或水浴中，保温3h。 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置1015min后放入冰水内。其余步骤同样品。 85%硫酸处理：当试管放入