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论文

目录

摘要……………………………………………………………………………………………3

关键词…………………………………………………………………………………………3

1银翘片的介绍………………………………………………………………………………4

2维生素C的介绍…………………………………………………………………………4

2.1简单介绍…………………………………………………………………………………4

2.2理化性质…………………………………………………………………………………4

3实验方法…………………………………………………………………………………4

3.1碘量法…………………………………………………………………………………4

3.2维生素C的高效液相色谱法定量测定…………………………………………………6

3.3荧光法……………………………………………………………………………………11

3.44-二硝基苯肼法………………………………………………………………………13

3.52，6-二氯靛酚滴定法……………………………………………………………15

参考文献……………………………………………………………………………………17

摘要：

分析了银翘片中的维生素C含量的测定，对银翘片和维生素C的介绍及根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。

主要用的测定方法有：

碘量法；高效液相色谱法；荧光法；2，4-二硝基苯肼法 （总VC）和2，6-二氯靛酚法 （还原型VC）

关键词：

银翘片维生素C碘量法高效液相色谱法荧光法

1银翘片的介绍

〖主要成分〗金银花、连翘、荆芥、淡牛股、牛蒡子、桔梗、薄荷油、芦根、淡竹叶、维生素C、马来酸氯苯那敏、对乙酰基酚等13味、辅料为淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、食用色素。

〖性状〗本品为糖衣片，除去糖衣后显灰褐色，略带有少许白色斑点，或显灰褐色与白色或淡黄色层；气微，味微苦。

〖功能主治〗辛凉解表，清热解毒。

用于流行性感冒引起的发热头痛，咳嗽，口干，咽喉疼痛。

2维生素C的介绍

2.1简单介绍

维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。

它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。

维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。

在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。

如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。

2.2理化性质

本品为白色结晶或结晶粉末；无臭，味酸；久置色渐变微黄。

在水中易溶，水溶液呈酸性，在乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中部溶。

分子中有两个手性碳原子，因而具有旋光性。

与糖的结构相似，具有糖类性质的反应结构中的烯二醇具有极强的还原性，易被氧化为去氢维生素，氢化又可还原为维生素C。

维生素C分子中具有烯二醇结构，故维生素C显酸性，能与碳酸氢钠作用生成钠盐

维生素C分子结构具有共轭双键，在稀盐酸溶液中，243nm波长处有最大吸收；若在中性或碱性条件下，则波长红移至265nm

3实验方法

根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。

常用的测定方法有：

碘量法；高效液相色谱法；荧光法；2，4-二硝基苯肼法 （总VC）和2，6-二氯靛酚法 （还原型VC）

3.1碘量法

3.1.1试验目的

（1）掌握碘标准溶液的配制与标定

（2）熟悉直接碘量法的原理

（3）学习维生素C的含量测定方法

3.1.2试验原理

Gr2O72-+6I-+14H+——→2Gr3++3I2+7H2O

I2+2S2O32-——→2I-+S4O62-

C（K2Gr2O7）V（K2Gr2O7）

C（Na2S2O3）=-------------------×6

V（Na2S2O3）

C6H8O6+I2→C6H6O6+2HI

C（I2）V（I2）M（C6H8O）

W（C6H8O6）=--------------------×100%

M（试样）

3.1.3仪器和试剂

仪器：

棕色试剂瓶（500ml）分析天平、吸滤瓶、量筒（50ml.100ml）、碘量瓶（250ml）、试剂瓶（500ml）、锥形瓶（250ml）、烧杯（500ml）、砂芯漏斗、酸式滴定管（50ml）、移液管（25.00ml）台秤及研钵、棕色容量瓶（1000ml）等

试剂：

碘（A.R.）、维生素C片剂、0.5%淀粉指示剂、Na2S2O35H2O、Na2CO3、K2Gr2O7（120℃烘干）、HCl（mol）、KI（20％）溶液、碘化钾（A.R.）、HAC（2mol/l）、硫代硫酸钠（0.1mol/l）、HAC（2mol/l）等

3.1.4实验步骤

（1）0.05MOL/L碘标准溶液的配制

称取6.6g和10gKI置于玻璃研钵中，加少量水研磨，待碘全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶中，加两滴浓盐酸，用蒸馏水稀释至500ml,摇匀，用砂芯漏斗过滤后，置于阴暗处保存

（2）碘溶液的标定

准确称取25.00ml碘溶于250ml锥形瓶中加入50ml蒸馏水，用前一试验已标定过的0.1mol/LNa2S2O4标准溶液滴定至浅黄色，加入2ml淀粉指示剂继续滴定至溶液的蓝色恰好消失，即为终点，平行标定3次，记录消耗的Na2S2O4标准溶液的体积，计算I2标准溶液的浓度。

表3-1Na2S2O4标准溶液的配制与标定

试样/数据处理

（1）

（2）

（3）

称样前m（K2Gr2O7）g

22.1840

22.1840

22.1840

称样后m（K2Gr2O7）g

20.1901

22.1901

22.1901

m（K2Gr2O7）g

1.9939

1.9939

1.9939

V（Na2S2O4）/（mL）

38.01

37.98

38.01

C（Na2S2O4/

（mol/L）

0.1070

0.1071

0.1070

平均浓度

0.1070

Rd

0.0312

表3-20.1mol/LI2标准溶液的配制与标定

试样/数据处理

称m（I2+KI）g

12.8000

平均C（Na2S2O4）/（mol/L）

0.1070

V（Na2S2O4）/（mL）

25.00

25.00

25.00

V（I2）/（mL）

13.06

13.02

13.05

C（I2）/mol

0.1024

0.1027

0.1025

平均浓度

0.1025

Rd

0.0976

（3）维生素C含量的测定

准确称取0.2g研碎的维生素C于250ml锥形瓶中，加入100ml新煮沸过的冷蒸馏水，

2MOL/LHAC溶液10ml使之溶解，加入2ml淀粉指示剂，立即用I2标准溶液地至溶液呈蓝色并保持0.5min不退色，即为终点。

平行滴定3次，记录I2标准溶液的用量，计算维生素C的含量。

表3-3VC药中VC含量的测定

试样/数据处理

称m（VC药片）

0.0750

平均C（I2）/mol

0.1025

V（I2）/（mL）

W（C6H8O6）

平均W（C6H8O6）

Rd

3.2维生素C的高效液相色谱法定量测定

3.2.1所用仪器和试剂：

（1）仪　器：

Agilent1100安捷伦高效液相色谱仪，二极管阵列检测器；高压输液泵均为（美国惠普公司）；色谱柱HYPERSIL-C18（5μm,150mm*4.6mm）（中国科学院兰州化学物理研究所）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；平头微量进样器（25uL）；AE系列电子天平（精确度为0.00001）（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；SQ2119N多功能食品榨汁机（上海帅佳电子科技有限公司）。

（2）试　剂:

维生素C标准对照品（维生素C含量99.7%,中国医药集团化学试剂公司制）；草酸（分析纯,中国医药集团化学试剂有限公司）；福建蜜柚（市售）；三次蒸馏水；甲醇（色谱纯，上海化学试剂研究所）；无水磷酸二氢钾（分析纯，上海实意化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（分析纯，中国医药集团化学试剂有限公司）。

3.2.2样品处理及实验条件

取本品研磨均匀的细粉适量（约相当于维生素C22.5mg），置50ml量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素C对照品同法测定，用峰面积以外标法计算，即得。

维生素C标准溶液的制备:

准确称取维生素C标准品50mg于小烧杯中，用0.1%草酸溶液溶解,转移至50mL棕色容量瓶中，稀释至刻度,得到维生素C含量为1000μg/mL的标准溶液。

HPLC检测条件:

A:

pH6.0，0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液,B:

甲醇;（A:

B=80:

20V/V）为流动相溶液[11-12]，流速1.0mL/min；检测波长254nm，进样量10μL，柱箱温度25℃。

3.2.3结果与讨论

（1）维生素C检测波长的选择

维生素C溶液在254nm有最大吸收，故本实验以254nm作为检测波长。

（2）样品溶剂的选择

液体维生素C具有较强的还原性,易受空气、热、光等因素影响,但在酸性溶液中却很稳定.为防止样品及标样中维生素C被氧化分解[8]，用0.1%草酸溶液作溶剂来溶解样品及标样。

（3）流动相的选择

流动相pH值的选择：

考虑到维生素C在酸性环境中比较稳定，所以选择调整流动相PH值为酸性。

经过采用不同值的实验证明，pH值在5.0-6.5之间，维生素C的吸收比较大，灵敏度比较高，最终选择pH为6.0[11-12]。

流动相的配比选择：

经实验：

pH6.0,0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与甲醇配比从85：

15；80：

20；75：

25；70：

30；但80：

20峰形较好，考虑到了出峰快了杂质干扰较大，出峰慢了，实验时间变长，最后确定了80：

20的配比[9]。

（4）标准工作曲线绘制

用0.1%草酸溶液分别配制浓度20mg.L-1，40mg.L-1，60mg.L-1，80mg.L-1，100mg.L-1维生素C标准溶液,定容至50mL，溶液用0.45μm虑膜（水型）过滤后用微量进样器（25μL）进样10uL.测定出维生素C标准溶液浓度对应的峰面积；然后以VC标准溶液浓度（mg/L）作自变量，相对应的峰面积作因变量；绘制标准工作曲线见图3-1

图3-1维生素C的标准工作曲线

（5）回收率实验

在测定完蜜柚样品溶液中的维生素C含量后，分别取样品5mL,再在样品中加入浓度为100μg/mL的维生素标准溶液，定容至25mL，进行峰面积的测定，然后将得到的峰面积代入线性回就可以得到一个相应的Vc测量值,经计算即可得到VC的回收率。

具体加收率试验结果见表3-4

表3-4　回收率实验结果

编号

样品中维

生素C量/μg

加入维生素C标准样品量/μg

测得的维生素C量/μg

回收率/%

1

194.25

100

271.86

92.39

2

194.25

200

378.24

95.94

3

194.25

300

531.32

107.50

4

194.25

400

630.38

106.08

5

194.25

500

664.19

95.67

（6）精密度实验

同一蜜柚样品在同一实验条件下测定8次,实验结果见表3-5.标准样品色谱图见图3-2，蜜柚色谱图见图3-3，其1.580min峰为标准样品维生素C色谱峰，1.589min峰为蜜柚样品维生素C色谱峰。

表3-5精密度实验结果（n=8）

维生素C测定结果mg/100mL

平均值mg/100mL

标准偏差

相对标准偏差/%

38.97,38.95

38.42,38.44

38.88,39.77

39.07,38.33

38.85

0.4696

1.21

图3-2标准样品色谱图

图3-3蜜柚样品色谱图

3.2.4结论

由于维生素C对光不稳定，遇氧易分解，故本实验应避光操作，整个实验均用棕色容量瓶定容[13]；流动相均需色谱纯度，水用高纯度水，脱气后的流动相要小心尽量不引起气泡；所有过柱子的液体均需严格的过滤；压力不能太大，最好不要超过150Bar。

由图3-1可知,其标准工作曲线的相关系数R2为0.9994，说明曲线的线性关系较好,分析中受样品中其他杂质的影响较小。

从表3-4中可以看到,本文采用A：

pH6.0，0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液；B:

：

甲醇，（A:

B=80：

20V/V）作流动相的高效液相色谱法，测定蜜柚中维生素C的含量,回收率为92.4～107.5%，说明该方法具有所需试剂少、稳定、操作简便等特点。

从表3-5中可以得到：

精密度实验的相对标准偏差小于2%，说明该方法重复性和再现性都是比较高的。

而且从蜜柚样品色谱图中看到，该方法分析维生素C的含量大约需要2min，具有灵敏、快速的特点.由以上分析可知：

本文采用的分析方法是可靠的，它也适合于从其它蔬菜、水果中提取维生素C的测定[4][8]。

3.3荧光法

3.3.1原理 

样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。

脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。

本方法的最小检出限为0.022 g/ml。

3.3.2适用范围 

GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定 

3.3.3仪器 

（1）实验室常用设备。

（2）荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。

（3）打碎机。

3.3.4试剂 

本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。

（1）偏磷酸－乙酸液：

称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。

4℃冰箱可保存7～10天。

（2）0.15 mol/L硫酸：

取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。

（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：

以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。

（4）50％ 乙酸钠溶液：

称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。

（5）硼酸-乙酸钠溶液：

称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。

临用前配制。

（6）邻苯二胺溶液：

称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。

（7）0.04%百里酚蓝指示剂溶液：

称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。

变色范围：

pH=1.2 红色 

pH=2.8 黄色 

pH＞4.0 兰色 

（8）活性炭的活化：

加200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120℃烘箱中干燥，备用。

（9）标准 

抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：

准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。

抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）：

 取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。

定容前试pH值，如其pH＞2.2时，则应用溶液（4.3）稀释。

标准曲线的制备：

取下述"标准"溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。

3.3.5操作步骤 

（1）样品制备 

全部实验过程应避光。

称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。

如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。

匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。

当样品液含量在40~100μg/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。

（2）氧化处理：

分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。

（3）各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"标准"及"标准空白"。

（4）各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"样品"及"样品空白"。

（5）于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4℃冰箱中放置2h，取出备用。

（6）于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。

（7）荧光反应 

取"标准空白"溶液，"样品空白"溶液及（5.6）中"样品"溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。

在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。

标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。

3.3.6计算 

X=（c×V/m）×F×（100/1000） 

式中：

X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g； 

c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，μg/ml；

m-----试样质量，g； 

F------样品溶液的稀释倍数； 

V------荧光反应所用试样体积，ml。

例：

 测定每一制备溶液的荧光强度。

用标准溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。

由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（μg/ml），按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。

如：

取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml 

样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。

23×100×50×100

------------------------=52（mg/100g）

2.138×10×1000

3.3.7注意事项 

（1）大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。

（2）某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。

（3）活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。

我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。

3.44-二硝基苯肼法 

3.4.1原理 

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。

样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。

3.4.2适用范围 

GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。

3.4.3仪器 

（1）恒温箱：

37±0.5℃ 

（2）可见-紫外分光光度计 

（3）打碎机 

3.4.4试剂

本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。

（1）4.5mol/L硫酸：

谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml。

（2）85%硫酸：

谨慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中。

（3）2%2，4-二硝基苯肼溶液：

溶解2g 2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内，过滤。

不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。

（4）2%草酸溶液：

溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1000ml。

（5）1%草酸溶液：

稀释500ml 2%草酸溶液到1000ml。

（6）1%硫脲溶液：

溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中。

（7）2%硫脲溶液：

溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。

（8）1mol/L盐酸：

取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml。

（9）活性炭：

将100g活性炭加到750ml 1mol/L盐酸中，回流1~2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

（10）标准 

①抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：

溶解100mg纯抗坏血酸于100ml 1%草酸溶液中。

②标准曲线绘制 

加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。

取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。

抗坏血酸浓度为20μg/ml。

取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10及12μg/ml。

按样品测定步骤形成脎并比色。

以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。

3.4.5操作步骤 

（1）样品制备 

全部实验过程应避光。

①鲜样制备：

称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。

②干样制备：

称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。

③将上述两液过滤，滤液备用。

不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。

（2）氧化处理：

取25ml上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。

取10ml此氧化提取液，加入10ml 2%硫脲溶液，混匀。

（3）呈色反应 

①于三个试管中各加入4ml稀释液。

一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。

②3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。

空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10~15min后放入冰水内。

其余步骤同样品。

③85%硫酸处理：

当试管放入