环境微生物综合实验报告.docx

1、环境微生物综合实验报告环境微生物综合实验报告205作者： 日期:环境工程微生物学综合性试验报告环境水样微生物学指标检测学院:资源与环境学院专业：环境工程专业班级：环境131班组别：环境微生物实验B组组员:前言3实验目的和要求3采样安排 医学院采样点分布图 西安工业大学采样点分布图医学院采样过程照片5西安工业大学采样过程照片6采样数据记录表 6材料方法6实验所用主要仪器设备及试剂仪器 培养基6实验原理与步骤 7实验一7实验二 7实验三 8实验四实验五9实验六0结果与分析1采样记录1水样总细菌群落测定 1大肠菌群检验初发酵结果的观察 14平板分离及革兰氏染色结果记录 1平板分离得到的阳性菌落的相应

2、特征记录 19复发酵结果的观察和大肠菌群数目的MP统计 20大肠菌群数目的MP统计21参考文献 21使用教材及参考书 环境工程微生物学综合性试验报告综合实验环境水样微生物学指标检测前言运用综合应用微生物学基本原理和基本实验技术,独立完成培养基的制备与灭菌操作及不同类型微生物的分离、纯化、观察、描述,可初步进行鉴定、分类（此步不作要求)。可以为污水、垃圾等生物处理进行相关的实验研究。实验目的和要求自来水、河、池、湖水、纯净水中微生物学指标的检测水样来源：西安工业大学湖水和西安医学院湖水、基本内容学习水样的采样方法，采用平板菌落计数技术测定水中细菌总数；采用多管发酵法（MPN）测定水中大肠菌群。说

3、明多管发酵法检测水样中大肠菌群的原理和操作过程。记录并报告实验结果。结果分析与讨论,经与国家标准比对检查,水质状况分析。、基本要求全面掌握微生物实验基本操作技能；掌握水中细菌总数测定方法;了解水质与细菌菌落之间的相关性；了解总大肠菌群数量指标在环境领域的重要性;掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。实验操作本实验需要的基本操作训练已经在前面的一些实验中学习过,在这里不再一一列出每一操作步骤。为了帮助预习,将有关操作名称列出,这些操作在建议参考书中都可以找到。1培养基配制和灭菌2无菌操作分离纯化3细菌染色和显微镜使用4菌落特征观察和描述5系列稀释方法6细菌鉴定指标测定采样安排内容安排：水样采集时

4、间:11月27日上午（一部分组员采样，一部分组员准备灭菌器具和配制培养基)步骤和注意事项：1.按照样品采集表(表1,见结果与分析)记录样点,编号，采样时间，天气，气温,水位，水质,现场监测项目(pH),采样人姓名。并画出采样湖的平面图,图上标示出采样点位置。医学院采样点分布图西安工业大学采样点分布图.容器应先用混合均匀的水样充分洗涤2次，然后正式取样;注意避免搅动沉积物而使水样受污染；采集表层水样时，应注意不能混入漂浮于水面上的物质。3 采样时的照片记录医学院采样过程照片西安工业大学采样过程照片采样数据记录表见结果与分析材料方法实验所用主要仪器设备及试剂仪器1显微镜 革兰氏染色用有关器材。 高

5、压蒸汽灭菌器。4干热灭菌箱。5恒温箱。6冰箱。7 放大镜。8 试管、平皿（直径9m)、刻度吸管等,置于干热灭菌箱中灭菌2h。培养基1乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨1g、牛肉膏3g、乳糖5g 、氯化钠g、 16%溴甲酚紫乙醇溶液1ml 蒸馏水100ml2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制 伊红美蓝固体培养基成分：蛋白胨10 、乳糖g、磷酸氢二钾2g 、琼脂粉5g、蒸馏水1000ml、2%伊红水溶液0ml、 0. 美蓝水溶液13ml 4牛肉膏蛋白胨固体培养基胰化蛋白胨1g、酵母提取物g、NaCl 10g、蒸馏水000ml、用1o/NaH调p至7.、琼脂粉0 实验原理与步骤实

6、验一内容安排:水样采集时间：11月27日上午步骤和注意事项：.按照样品采集表（表1）记录样点，编号,采样时间，天气,气温，水位,水质,现场监测项目(pH),采样人姓名。并画出采样湖的平面图，图上标示出采样点位置2.容器应先用混合均匀的水样充分洗涤2次，然后正式取样;注意避免搅动沉积物而使水样受污染;采集表层水样时，应注意不能混入漂浮于水面上的物质。3.采样时的照片记录实验二内容安排：水样总菌落数测定及大肠菌群检验之初发酵实验时间：1月29日9：00到2：00步骤和注意事项:一.按照每组检测两个水样准备要进行灭菌的玻璃器皿和试剂，包括:进行水样总菌落数测定和大肠菌群检验初发酵实验的试管、移液管和

7、三角瓶等。试管1支（水样总菌落数测定中稀释6个梯度需支,两个水样一共0支；大肠菌群检验初发酵实验发酵管需4支，两个水样一共支);三角瓶个（水样总菌落数测定中初次稀释需1个,两个水样共2个);移液管10只(水样总菌落数测定梯度稀释需10l一支,2ml的支,两个水样共10支);培养皿12个(水样总菌落数测定共涂板个梯度，每个梯度个板子,共6个,两个水样共2个）;2.准备培养基:a.供大肠菌群检验之初发酵和复发酵实验的普通乳糖蛋白胨培养液(每只试管5到m，一个水样管,两个水样共6管，加上复发酵需用的，至少准备20L，可以一次配制30mL，供组使用）；b.供大肠菌群检验之初发酵实验的三倍浓缩乳糖蛋白胨

8、培养液（每只试管5到10L，一个水样管，两个水样共2管至少准备0L，一个班配制200L,供全部小组使用)；c.供水样总菌落数测定的蛋白胨固体培养基(每只培养皿25m左右，1个培养皿0L，每组至少配制00L)3.发酵管的准备:将支洗净的杜氏小管装入4个试管中，2个水样共准备8支装有杜氏小管的试管,然后在其中的6支中灌入普通乳糖蛋白胨培养液，2支灌入三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（注意，将大试管倾斜45度左右或更大角度，慢慢注入培养液，使培养液在进入大试管的同时缓缓进入大试管中的杜氏小管中，并将杜氏小管中的空气挤压出去,若灌完培养液后仍有气体存在，可以用指头轻弹试管壁将之震出）;4.灭菌水的准备,每组至

9、少准备00mL纯净水进行灭菌。二灭菌:1.将配制好的牛肉膏蛋白胨固体培养基和分装好普通乳糖蛋白胨培养液和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管，以及剩下的未用完的普通乳糖蛋白胨培养液和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液，还有之前准备好的各项玻璃器皿包装好放入灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。灭菌完毕后，一部分人进行水样的梯度稀释（注意,初次稀释要进行大体积稀释，例如将20L水样加入180灭菌水中；每一步稀释都必须保证将水样混匀,特别是在进行试管稀释时，切记）;同时,一部分组员进行牛肉膏蛋白胨平板的倒板工作（若选择直接倒板法涂板的可不用进行此部分);稀释用的移液管要编号保存,后面涂LB平板的时候要对应吸取稀释的水样；2.

10、大肠菌群检验初发酵管的接种:将0mL原始水样加入到装有三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中,1mL原始水样加入支装有普通乳糖蛋白胨培养液的发酵管中;稀释和10的水样分别加入装有普通乳糖蛋白胨培养液发酵管中将接种完毕的发酵管放入培养箱中培养24h到48h3.水样总菌落数测定之涂平板：从1-3到1-稀释梯度中选择3个梯度的稀释水样进行LB平板的涂板,方法可选用倒板法（在平板中加入1mL水样后倒入20m LB培养基（培养基温度必须控制在以下，倒板速度要快，防止倒板过程中LB固体培养基凝固)或涂板法(将1L菌液加入到制好的L平板上，再使用涂布器涂匀，涂布器每次使用前都要酒精灯干热灭菌，冷却后再涂板)；涂

11、制好的平板放入7培养箱中培养24到h。实验三内容安排:水样总菌落数测定及大肠菌群检验之初发酵实验结果观察和记录时间:1月29日早上9：00到2:0(一部分组员进行实验二的结果观察和记录,一部分组员进行实验四的内容，先制作伊红美蓝培养基，清洗出计数后不用的培养皿（按照初发酵实验结果，有几个阳性结果准备几个培养皿）进行包裹灭菌,和制备好的伊红美蓝培养基一同灭菌）步骤和注意事项:1.水样总菌落数测定结果的观察(记录到表2中）菌落计数：肉眼观察,可用放大镜,可标记；必要时分区计数，菌落成片者作废。计算方法:a某稀释度的菌落数=两平板菌落数取平均值。b.计数标准:选择菌落数在0-30之间的稀释度仅有一个

12、稀释度在此范围：总菌落数菌落数稀释倍数;有两个稀释度在030之间，两梯度菌落数之比（两个稀释梯度涂板后所长的菌落数的比例）2，选较小值作为菌落数进行计算，菌落数之比，取平均值；所有稀释度均300,取稀释倍数最大者的菌落数进行计算；所有稀释度均3,取稀释倍数最小者的菌落数进行计算；没有任何稀释度在0-00之间，选最接近该范围者;c结果单位：CF/md稀释度选择及细菌总数结果记录2大场菌群检验初发酵结果的观察按照表进行初发酵结果的记录,产气变色、产气不变色、变色不产气和不产气不变色但变浑浊均为可疑阳性予以记录，不产气不变色也不浑浊为阴性记录，产气不变色不浑浊为操作失误。实验四内容安排:大肠菌群检验

13、之平板分离实验时间：1月30日1:0到21:00步骤和注意事项:1.伊红美蓝固体培养基的配制按照课本上的方式配制伊红美蓝固体培养基，按照初发酵实验结果（有几个阳性结果准备几个培养皿）准备所需培养基量(每个平板20-2m）;2.灭菌将准备好的伊红美蓝培养基以及倒平板所需的培养皿(按照初发酵阳性结果数目进行准备）;.倒板将灭菌好的伊红美蓝培养基倒入灭菌培养皿完成制板;4.涂板或划线将初发酵实验中阳性管中的菌液稀释一定倍后(菌液浑浊度大的稀释倍数适当放大）吸取m稀释菌液进行涂板，或者直接使用接种环沾取初发酵阳性菌液进行平板划线，划线方式按图进行,划线后的平板放入37培养箱培养24h。实验五内容安排：

14、大肠菌群检验之平板分离实验结果观察、革兰氏染色和复发酵实验时间:月2日10:00到12:00(一部分组员进行实验四结果的观察和记录并进行革兰氏染色,另一部分组员进行复发酵实验需用的普通乳糖蛋白胨培养液的准备，之后对灭菌后的复发酵管进行接种)步骤和注意事项：1.复发酵管的准备直接准备4个装有杜氏小管的发酵管，按照实验二的介绍加入实验二时剩下的普通乳糖蛋白胨培养液(每管5或1mL，若剩下的培养基已经受污染，则必须重新配制）。.灭菌将步骤1中准备好的复发酵管进行灭菌。平板分离实验结果观察在灭菌等待过程中，进行平板分离实验结果观察,其中平板上的菌落若符合以下颜色特征则标记为阳性菌落。深紫黑色，具有金属光泽的菌落;紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落;淡紫红色,中心色较深的菌落。4 革兰氏染色挑取步骤3中的阳性菌落的一小部分进行革兰氏染色（步骤如下)，记录结果。a用培养184的培养