环境微生物综合实验报告.docx

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环境微生物综合实验报告

环境微生物综合实验报告20１5

————————————————————————————————　作者：

————————————————————————————————日期:

ﻩ

《环境工程微生物学》

综合性试验报告

环境水样微生物学指标检测

学院:

资源与环境学院

专业：

环境工程专业

班级：

环境131班

组别：

环境微生物实验B组

组员:

前言ﻩ3

实验目的和要求ﻩ3

采样安排４

医学院采样点分布图４

西安工业大学采样点分布图ﻩ５

医学院采样过程照片ﻩ5

西安工业大学采样过程照片ﻩ6

采样数据记录表6

材料方法ﻩ6

实验所用主要仪器设备及试剂ﻩ６

仪器６

培养基ﻩ6

实验原理与步骤7

实验一ﻩ7

实验二7

实验三8

实验四ﻩ９

实验五ﻩ9

实验六ﻩ１0

结果与分析ﻩ1１

采样记录ﻩ１1

水样总细菌群落测定1１

．大肠菌群检验初发酵结果的观察14

平板分离及革兰氏染色结果记录1６

平板分离得到的阳性菌落的相应特征记录19

复发酵结果的观察和大肠菌群数目的MPＮ统计20

大肠菌群数目的MPＮ统计ﻩ21

参考文献21

使用教材及参考书２１

《环境工程微生物学》综合性试验报告

——综合实验环境水样微生物学指标检测

前言

  运用综合应用微生物学基本原理和基本实验技术,独立完成培养基的制备与灭菌操作及不同类型微生物的分离、纯化、观察、描述,可初步进行鉴定、分类（此步不作要求）。

可以为污水、垃圾等生物处理进行相关的实验研究。

实验目的和要求

自来水、河、池、湖水、纯净水中微生物学指标的检测

水样来源：

西安工业大学湖水和西安医学院湖水

１、基本内容

●学习水样的采样方法，采用平板菌落计数技术测定水中细菌总数；采用多管发酵法（MPN）测定水中大肠菌群。

说明多管发酵法检测水样中大肠菌群的原理和操作过程。

●记录并报告实验结果。

●结果分析与讨论,经与国家标准比对检查,水质状况分析。

２、基本要求

●全面掌握微生物实验基本操作技能；

●掌握水中细菌总数测定方法;了解水质与细菌菌落之间的相关性；

●了解总大肠菌群数量指标在环境领域的重要性;

●掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。

实验操作

    本实验需要的基本操作训练已经在前面的一些实验中学习过,在这里不再一一列出每一操作步骤。

为了帮助预习,将有关操作名称列出,这些操作在建议参考书中都可以找到。

1．培养基配制和灭菌

2．无菌操作分离纯化

3．细菌染色和显微镜使用

4．菌落特征观察和描述

5．系列稀释方法

6． 细菌鉴定指标测定

采样安排

内容安排：

水样采集

时间:

11月27日上午（一部分组员采样，一部分组员准备灭菌器具和配制培养基）

步骤和注意事项：

1.按照样品采集表（表1,见结果与分析）记录样点,编号，采样时间，天气，气温,水位，水质,现场监测项目（pH）,采样人姓名。

并画出采样湖的平面图,图上标示出采样点位置。

医学院采样点分布图

西安工业大学采样点分布图

２.容器应先用混合均匀的水样充分洗涤2~３次，然后正式取样;注意避免搅动沉积物而使水样受污染；采集表层水样时，应注意不能混入漂浮于水面上的物质。

3．采样时的照片记录

医学院采样过程照片

西安工业大学采样过程照片

采样数据记录表

见结果与分析

材料方法

实验所用主要仪器设备及试剂

仪器

1　显微镜２革兰氏染色用有关器材。

３高压蒸汽灭菌器。

4　干热灭菌箱。

5　恒温箱。

6　冰箱。

7放大镜。

8试管、平皿（直径9ｃm）、刻度吸管等,置于干热灭菌箱中１６０℃灭菌2h。

培养基

1乳糖蛋白胨培养液

成分：

蛋白胨1０g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠５g、1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml

蒸馏水10０0ml

2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液

按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制

３伊红美蓝固体培养基

成分：

蛋白胨10ｇ、乳糖１０g　、磷酸氢二钾2g、琼脂粉２5g、蒸馏水1000ml　、2%伊红水溶液２0ml、0.５％美蓝水溶液13ml

4　牛肉膏蛋白胨固体培养基

胰化蛋白胨1０g、酵母提取物５g、NaCl10g、蒸馏水１000ml、用1ｍoｌ/ＬNaＯH调pＨ至7.０、琼脂粉２0ｇ

实验原理与步骤

实验一

内容安排:

水样采集

时间：

11月27日上午

步骤和注意事项：

１.按照样品采集表（表1）记录样点，编号,采样时间，天气,气温，水位,水质,现场监测项目（pH）,采样人姓名。

并画出采样湖的平面图，图上标示出采样点位置

2.容器应先用混合均匀的水样充分洗涤2~３次，然后正式取样;注意避免搅动沉积物而使水样受污染;采集表层水样时，应注意不能混入漂浮于水面上的物质。

3.采样时的照片记录

实验二

内容安排：

水样总菌落数测定及大肠菌群检验之初发酵实验

时间：

１1月29日　9：

00到１2：

00

步骤和注意事项:

一.按照每组检测两个水样准备要进行灭菌的玻璃器皿和试剂，包括:

１．进行水样总菌落数测定和大肠菌群检验初发酵实验的试管、移液管和三角瓶等。

试管1８支（水样总菌落数测定中稀释6个梯度需５支,两个水样一共１0支；大肠菌群检验初发酵实验发酵管需4支，两个水样一共８支）;

三角瓶２个（水样总菌落数测定中初次稀释需1个,两个水样共2个）;

移液管10只（水样总菌落数测定梯度稀释需10ｍl一支,2ml的４支,两个水样共10支）;

培养皿12个（水样总菌落数测定共涂板３个梯度，每个梯度２个板子,共6个,两个水样共１2个）;

2.准备培养基:

a.供大肠菌群检验之初发酵和复发酵实验的普通乳糖蛋白胨培养液（每只试管5到１０mＬ，一个水样３管,两个水样共6管，加上复发酵需用的，至少准备１20ｍL，可以一次配制30０mL，供２组使用）；

b.供大肠菌群检验之初发酵实验的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（每只试管5到10ｍL，一个水样１管，两个水样共2管至少准备２0ｍL，一个班配制200ｍL<老师指定人员配制>,供全部小组使用）；

c.供水样总菌落数测定的蛋白胨固体培养基（每只培养皿25mＬ左右，1２个培养皿３０0ｍL，每组至少配制３00ｍL）

3.发酵管的准备:

将４支洗净的杜氏小管装入4个试管中，2个水样共准备8支装有杜氏小管的试管,然后在其中的6支中灌入普通乳糖蛋白胨培养液，2支灌入三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（注意，将大试管倾斜45度左右或更大角度，慢慢注入培养液，使培养液在进入大试管的同时缓缓进入大试管中的杜氏小管中，并将杜氏小管中的空气挤压出去,若灌完培养液后仍有气体存在，可以用指头轻弹试管壁将之震出）;

4.灭菌水的准备,每组至少准备５00mL纯净水进行灭菌。

二．灭菌:

1.将配制好的牛肉膏蛋白胨固体培养基和分装好普通乳糖蛋白胨培养液和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管，以及剩下的未用完的普通乳糖蛋白胨培养液和三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液，还有之前准备好的各项玻璃器皿包装好放入灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。

灭菌完毕后，一部分人进行水样的梯度稀释（注意,初次稀释要进行大体积稀释，例如将20ｍL水样加入180ｍＬ灭菌水中；每一步稀释都必须保证将水样混匀,特别是在进行试管稀释时，切记）;同时,一部分组员进行牛肉膏蛋白胨平板的倒板工作（若选择直接倒板法涂板的可不用进行此部分）;稀释用的移液管要编号保存,后面涂LB平板的时候要对应吸取稀释的水样；

2.大肠菌群检验初发酵管的接种:

将１0mL原始水样加入到装有三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵管中,1mL原始水样加入１支装有普通乳糖蛋白胨培养液的发酵管中;稀释１０－１和10－２的水样分别加入装有普通乳糖蛋白胨培养液发酵管中将接种完毕的发酵管放入３７℃培养箱中培养24h到48h．

3.水样总菌落数测定之涂平板：

从1０-3到1０-６稀释梯度中选择3个梯度的稀释水样进行LB平板的涂板,方法可选用倒板法（在平板中加入1mL水样后倒入20mＬLB培养基（培养基温度必须控制在４０℃以下，倒板速度要快，防止倒板过程中LB固体培养基凝固）或涂板法（将1ｍL菌液加入到制好的LＢ平板上，再使用涂布器涂匀，涂布器每次使用前都要酒精灯干热灭菌，冷却后再涂板）；涂制好的平板放入３7℃培养箱中培养24ｈ到４８h。

实验三

内容安排:

水样总菌落数测定及大肠菌群检验之初发酵实验结果观察和记录

时间:

1１月29日早上9：

00到１2:

０0（一部分组员进行实验二的结果观察和记录,一部分组员进行实验四的内容，先制作伊红美蓝培养基，清洗出计数后不用的培养皿（按照初发酵实验结果，有几个阳性结果准备几个培养皿）进行包裹灭菌,和制备好的伊红美蓝培养基一同灭菌）

步骤和注意事项:

1.水样总菌落数测定结果的观察（记录到表2中）

①菌落计数：

肉眼观察,可用放大镜,可标记；必要时分区计数，菌落成片者作废。

②计算方法:

a．某稀释度的菌落数=两平板菌落数取平均值。

b.计数标准:

选择菌落数在３0-3０0之间的稀释度

●仅有一个稀释度在此范围：

总菌落数＝菌落数×稀释倍数;

●有两个稀释度在３0－30０之间，两梯度菌落数之比（两个稀释梯度涂板后所长的菌落数的比例）>2，选较小值作为菌落数进行计算，菌落数之比＜２，取平均值；

●所有稀释度均>300,取稀释倍数最大者的菌落数进行计算；

●所有稀释度均<3０,取稀释倍数最小者的菌落数进行计算；

●没有任何稀释度在３0-３00之间，选最接近该范围者;

c．结果单位：

CFＵ/mｌ

d．稀释度选择及细菌总数结果记录

2．大场菌群检验初发酵结果的观察

按照表３进行初发酵结果的记录,产气变色、产气不变色、变色不产气和不产气不变色但变浑浊均为可疑阳性予以记录，不产气不变色也不浑浊为阴性记录，产气不变色不浑浊为操作失误。

实验四

内容安排:

大肠菌群检验之平板分离实验

时间：

1１月30日1９:

３0到21:

00

步骤和注意事项:

1.伊红美蓝固体培养基的配制

按照课本上的方式配制伊红美蓝固体培养基，按照初发酵实验结果（有几个阳性结果准备几个培养皿）准备所需培养基量（每个平板20-2５mＬ）;

2.灭菌

将准备好的伊红美蓝培养基以及倒平板所需的培养皿（按照初发酵阳性结果数目进行准备）;

３.倒板

将灭菌好的伊红美蓝培养基倒入灭菌培养皿完成制板;

4.涂板或划线

将初发酵实验中阳性管中的菌液稀释一定倍后（菌液浑浊度大的稀释倍数适当放大）吸取１mＬ稀释菌液进行涂板，或者直接使用接种环沾取初发酵阳性菌液进行平板划线，划线方式按图１进行,划线后的平板放入37℃培养箱培养24h。

实验五

内容安排：

大肠菌群检验之平板分离实验结果观察、革兰氏染色和复发酵实验

时间:

１２月2日10:

00到12:

00（一部分组员进行实验四结果的观察和记录并进行革兰氏染色,另一部分组员进行复发酵实验需用的普通乳糖蛋白胨培养液的准备<如果实验二中剩下的普通乳糖蛋白胨培养液没有受污染则直接使用,准备复发酵管，并进行灭菌>，之后对灭菌后的复发酵管进行接种）

步骤和注意事项：

1.复发酵管的准备

直接准备4个装有杜氏小管的发酵管，按照实验二的介绍加入实验二时剩下的普通乳糖蛋白胨培养液（每管5或1０mL，若剩下的培养基已经受污染，则必须重新配制）。

２.灭菌

将步骤1中准备好的复发酵管进行灭菌。

３．平板分离实验结果观察

在灭菌等待过程中，进行平板分离实验结果观察,其中平板上的菌落若符合以下颜色特征则标记为阳性菌落。

深紫黑色，具有金属光泽的菌落;

紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落;

淡紫红色,中心色较深的菌落。

4．革兰氏染色

挑取步骤3中的阳性菌落的一小部分进行革兰氏染色（步骤如下），记录结果。

a．用培养18～２4ｈ的培养