猪常见病PCR检测程序.docx

1、猪常见病PCR检测程序猪病检测手册猪瘟检测程序 3猪繁殖与呼吸综合症检测程序 5高致病性猪繁殖与呼吸综合症检测程序 7猪流行性乙型脑炎检测程序 9猪伪狂犬病毒（）检测程序 11猪细小病毒（）检测程序 13猪圆环病毒型（2）检测程序 15细菌学检测程序 17 猪瘟检测程序一 、病毒的提取1、阳性对照的提取材料 冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5蒸馏水或液稀释，用1 管分装，每管500l，-20保存。取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于的提取。提取按试剂盒说明进行，最后用50l 水溶解，得到溶液。2、疑似病料的提取样品采集 采

2、集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5 （7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5灭菌离心管中，8000离心2，取上清液用于的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于的提

3、取。 提取 待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50l 水溶解，得到溶液。二、 反应1、材料 试剂盒（东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5-3 , 19 ，为61.88。 R：5-3, 20，为59.85。扩增的目的片段为133。 2、 体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料 水6l0特异性下游引物1l1l模板5l11l12l12l置于仪上6510，立即冰浴5。然后加入以下试剂：变性后的溶液12l5 4l 2l 1l 1l20l按以下程序反转录： 1、 42，45 2、 99, 5将 -20保存。 3、 反应体系及程序2O7.5l3l上游引物1l下游引物1l2 12.

4、5l25l反应程序： 1、94，32、95，303、56，30 354、72，15、72，10三、电泳 用电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100加入5l染色液。8070电泳40观察结果，在阳性对照出现133条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现133的条带，判定为猪瘟病毒阳性。猪繁殖与呼吸综合症检测程序一 、病毒的提取1、阳性对照的提取材料 冻干弱毒疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 将1瓶弱毒冻干疫苗用2生理盐水或液稀释，用1 管分装，每管200l，-20保存。取出冻存的病毒，解冻后用于的提取。提取按试剂盒说明进行，最后用50l 水溶解，得到溶液。2、疑似病料的提取样

5、品采集 病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5 （7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5灭菌离心管中，8000离心2，取上清液用于的

6、提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于的提取。提取 待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50l 水溶解，得到溶液。二、 反应1、材料 试剂盒（日本东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5 -3 , 18，为59.58。 R：5-3, 20，为57.8。扩增的目的片段为468。2、体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料 水6l0特异性下游引物1l1l模板5l11l12l12l置于仪上6510，立即冰浴5。然后加入以下试剂：变性后的溶液12l5 4l 2l 1l 1l20l按以下程序反转录： 1、 42，45 2、 99, 5将 -20保存。 3、 反应体系及程序2O7.5l

7、3l上游引物1l下游引物1l2 12.5l25l反应程序： 1、94，32、95，303、56，30 354、72，15、72，10三、电泳用电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100加入5l染色液。8070电泳50观察结果，在阳性对照出现468条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现468的条带，判定为病毒阳性。 高致病性猪繁殖与呼吸综合症检测程序一 、病毒的提取1、阳性对照的提取材料 阳性对照病料为该病的活疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 提取按试剂盒说明进行，最后用50l 水溶解，得到溶液。2、疑似病料的提取样品采集 病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟

8、淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5 继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心5，取上清液用于的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于的提取。提取 待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50l

9、 水溶解，得到溶液。二、 反应1、材料 试剂盒（日本东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5 3 , 18，为55.56。 R：5- -3, 18，为61.11。扩增的目的片段为230。2、 体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料 水6l0特异性下游引物1l1l模板5l11l12l12l置于仪上6510，立即冰浴5。然后加入以下试剂：变性后的溶液12l5 4l 2l 1l 1l20l按以下程序反转录： 1、 42，45 2、 99, 5将 -20保存。 1、 反应体系及程序2O7.5l3l上游引物1l下游引物1l2 12.5l25l反应程序：1、94，32、95，303、5

10、2，30 354、72，15、72，10三、电泳用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100加入5l染色液。8070电泳40观察结果，在阳性对照出现230条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现230的条带，判定为高致病性病毒阳性。 猪流行性乙型脑炎检测程序一 、病毒的提取1、 阳性对照的提取材料 阳性对照病料为该病的弱毒疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。方法 提取按试剂盒说明进行，最后用50l 水溶解，得到溶液。2、疑似病料的提取样品采集 采集病死或扑杀的猪，取血液、腹股沟淋巴结、脑脊髓液、死产胎儿的脑组织、分泌物、脾、肿胀的睾丸等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注

11、射器取血5，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5生理盐水继续研磨，匀浆后-20反复冻融3次，转至1.5灭菌离心管中，8000离心2，取上清液用于的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于的提取。提取 待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50l 水溶解，得到溶液。三、 反应1、材料 试剂盒（东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。引物序

12、列：F：53 , 18，为59.58。R：5 -3, 20，为57.8。扩增的目的片段为238。1、 体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料 水6l0特异性下游引物1l1l模板5l11l12l12l置于仪上6510，立即冰浴5。然后加入以下试剂：变性后的溶液12l5 4l 2l 1l 1l20l按以下程序反转录： 1、 42，45 2、 99, 5将 -20保存。 2、 反应体系及程序2O7.5l3l上游引物1l下游引物1l2 12.5l25l反应程序： 1、94，32、95，303、53，30 354、72，15、72，10三、电泳用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100加入5l染

13、色液。8070电泳40观察结果，在阳性对照出现238条带、阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现238的条带，判定为猪流行性乙型脑炎病毒阳性。猪伪狂犬病毒（）检测程序一、 基因组提取及扩增1、 材料与试剂 提取试剂盒， 试剂盒购自天跟公司。引物 F：53 18，为59.58。R：5- -3 19，为59.72。扩增的目的片段为324。2、的提取 2.1样品采集 病死或扑杀猪，取血液、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿、神经系统如大脑等组织；待检活猪，用注射器取血5，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流

14、产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。2.2组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5 继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心5，取上清液用于的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于的提取。2.3 的提取 按试剂盒说明进行。二、扩增反应体系及程序：2O7.5l3l上游引物1l下游引物1l2 12.5l25l反应程序： 1、94，32、95，303、56，30 354、72，15、72，10三、电泳用电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100加入5l染

15、色液。8070电泳40观察结果，在阳性对照出现324条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现324的条带，判定为阳性。猪细小病毒（）检测程序一、 基因组提取1、材料与试剂 提取试剂盒， 试剂盒购自天跟公司。引物：F：53 22，为 58.21。R：5 -3 21，为58.01。扩增的目的片段为471。2、的提取 2.1样品采集 70日龄以内流产或产死胎儿的新鲜脏器（脑、肾、肝、肺、睾丸、胎盘及肠系膜淋巴结）等，其中以肠系膜淋巴结和肝脏的分离率最高，母猪的胎盘和阴道分泌物。2.2组织样品处理 称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5 继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心

16、5，取上清液用于的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于的提取。2.3 的提取 按试剂盒说明进行。二、扩增反应体系及程序：2O7.5l3l上游引物1l下游引物1l2 12.5l25l反应程序： 1、94，32、95，303、56，30 354、72，15、72，10三、电泳用电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100加入5l染色液。8070电泳40观察结果，在阳性对照出现471条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现471的条带，判定为阳性。猪圆环病毒型（2）检测程序二、 基因组提取及扩增1、材料与试剂 50 的溶液、1M （8.0）、 扩增试剂盒（东洋纺产品）。引物：F：53 20，为5

17、7.3。R：5-3 20 ，为55.75。扩增的目的片段为250。2、的提取2.1样品采集 取血液、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏等组织病变与健康部交界处组织（圆环病毒检测必须包括淋巴结样品）；待检活猪，用注射器取血5，4保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。2.2样品处理组织样品处理：称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5 继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心5，取上清液用于的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于的提取。二、扩增反应体系及程序：2O7.5l3l上游引物1l下游引物1l2 12.5l25l反应程序： 1、94，32、95，3

18、03、53，30 354、72，15、72，10三、电泳用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100加入5l染色液。8070电泳40观察结果，在阳性对照出现250条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现200多的条带，判定为2阳性。细菌学检测程序是一种多形态、非溶血性、不运动、依赖性的革兰氏阴性细小杆菌。大小为1.5*（0.30.4），多单个、也有短排排列，新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可成短链，并可形成荚膜，在陈旧培养物上呈多形态。无鞭毛、芽胞，美蓝染色呈两极。需氧或兼性厌氧，最适生长温度3537，7.67.8。初次分离培养时供给5102可促进生长，本菌培养需V因子或也可满足要求。

19、实验室使用血琼脂培养基中含有X因子及V因子，但血液中的V因子通常处于被抑制状态，通常不能在含有完整红细胞的血琼脂上生长，血液加热后，细胞膜上的抑制物被破坏，V因子释放，实验室分离通常使用巧克力琼脂培养基。在巧克力琼脂平板上经372448小时培养，生长的菌落呈圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、灰白色半透明的菌落，在马血琼脂平板上（加了）生长良好，划线接种在有葡萄球菌的血平板上24小时后呈现卫星生长，在划线周围菌落生长良好（现象），远离葡萄球菌的菌落较小。由于金黄色葡萄球菌等产色素的细菌及酵母菌，在生长过程中可合成V因子，并在培养中扩散，所以出现此现象1。本菌对外界的抵抗力不强。干燥环境中易死亡，6

20、0 520被杀死；4中一般只能存活710天；常用消毒剂都易杀死；对结晶紫、杆菌肽、红霉素、林可霉素、卡那霉素、磺胺等药物敏感，已发现耐药菌株。1.2 流行病学是猪上呼吸道的常在菌，能从健康动物的鼻腔、鼻分泌物、气管和扁桃体中分离到。只感染猪，主要危害2周龄至4月龄的猪只，特别是断奶前后和保育期仔猪多发。通常见于58周龄的猪，发病率一般在l015，死亡率可达50%。人工感染猪后引起多浆膜炎以及多关节炎等。主要存在于猪的上呼吸道(鼻腔、扁桃体和气管前段等)内，通过猪群间的接触和空气飞沫以及污染物而传播。带菌猪和感染猪为本病的传染源2。2007年等3在欧洲从野猪身上分离出，这是首次报道s病发生在野猪

21、，究竟是野猪感染后传染到家猪，还是家猪感染后传染到野猪身上，还有待研究。 等4(1997)研究表明，从鼻腔中部分离的副猪嗜血杆菌与急性化脓性鼻炎、鼻腔和气管粘膜的急性细胞肿胀以及纤毛丢失有关。常和猪流行性感冒、圆环病毒、蓝耳病、链球菌、伪狂犬病、弓形体、附红细胞体等混合感染，但具体还不清楚是继发感染还是触发因子，目前正处于研究阶段。培养基配制：1. 培养基：胰蛋白胨17g；酵母提取物6g；葡萄糖2.5g；、氯化钠5g；磷酸氢二钾 2.5 g；大豆胨 3 g，双蒸水1000，调7.2-7.6。121，15灭菌。待培养基冷却至50 ，加入2.5过滤除菌后的（0.01g）与5%牛血清。2. 培养基：胰蛋白胨17g；酵母提取物6g；葡萄糖2.5g；、氯化钠5g；磷酸氢二钾 2.5 g；大豆胨 3 g；琼脂15 g，双蒸水1000，调7.2-7.6。121，15灭菌。待培养基冷却至50 ，加入2.5过滤除菌后的（0.01g）与5%牛血清。