猪常见病PCR检测程序.docx

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猪常见病PCR检测程序

猪

病

检

测

手

册

猪瘟检测程序3

猪繁殖与呼吸综合症检测程序5

高致病性猪繁殖与呼吸综合症检测程序7

猪流行性乙型脑炎检测程序9

猪伪狂犬病毒（）检测程序11

猪细小病毒（）检测程序13

猪圆环病毒Ⅱ型

（2）检测程序15

细菌学检测程序17

猪瘟检测程序

一、病毒的提取

1、阳性对照的提取

材料冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。

方法将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5蒸馏水或液稀释，用1管分装，每管500µl，-20℃保存。

取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于的提取。

提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

2、疑似病料的提取

样品采集采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。

附：

通常木乃伊胎不能作为检测样品。

对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。

对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。

胎儿的保存方法同上。

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5（7.2）继续研磨制成1:

3的组织匀浆液，转至1.5灭菌离心管中，8000离心2，取上清液用于的提取；全血样品处理：

待血凝后取血清用于的提取。

提取待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

二、反应

1、材料试剂盒（东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。

引物序列：

F：

5’-3’,19，为61.88。

R：

5’-3’,20，为59.85。

扩增的目的片段为133。

2、体系及反应程序：

名称

弱毒疫苗阳性对照

检测病料

水

6µl

0

特异性下游引物

1µl

1µl

模板

5µl

11µl

12µl

12µl

置于仪上65℃10，立即冰浴5。

然后加入以下试剂：

变性后的溶液

12µl

5×

4µl

2µl

1µl

1µl

20µl

按以下程序反转录：

1、42℃，45

2、99℃,5

将-20℃保存。

3、反应体系及程序

2O

7.5µl

3µl

上游引物

1µl

下游引物

1µl

2×

12.5µl

25µl

反应程序：

1、94℃，3

2、95℃，30

3、56℃，30×35

4、72℃，1

5、72℃，10

三、电泳

用电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100加入5µl染色液。

8070电泳40观察结果，在阳性对照出现133条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现133的条带，判定为猪瘟病毒阳性。

猪繁殖与呼吸综合症检测程序

一、病毒的提取

1、阳性对照的提取

材料冻干弱毒疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。

方法将1瓶弱毒冻干疫苗用2生理盐水或液稀释，用1管分装，每管200µl，-20℃保存。

取出冻存的病毒，解冻后用于的提取。

提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

2、疑似病料的提取

样品采集病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。

附：

通常木乃伊胎不能作为检测样品。

对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。

对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。

胎儿的保存方法同上。

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5（7.2）继续研磨制成1:

3的组织匀浆液，转至1.5灭菌离心管中，8000离心2，取上清液用于的提取；全血样品处理：

待血凝后取血清用于的提取。

提取待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

二、反应

1、材料试剂盒（日本东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。

引物序列：

F：

5’-3’,18，为59.58。

R：

5’-3’,20，为57.8。

扩增的目的片段为468。

2、体系及反应程序：

名称

弱毒疫苗阳性对照

检测病料

水

6µl

0

特异性下游引物

1µl

1µl

模板

5µl

11µl

12µl

12µl

置于仪上65℃10，立即冰浴5。

然后加入以下试剂：

变性后的溶液

12µl

5×

4µl

2µl

1µl

1µl

20µl

按以下程序反转录：

1、42℃，45

2、99℃,5

将-20℃保存。

3、反应体系及程序

2O

7.5µl

3µl

上游引物

1µl

下游引物

1µl

2×

12.5µl

25µl

反应程序：

1、94℃，3

2、95℃，30

3、56℃，30×35

4、72℃，1

5、72℃，10

三、电泳

用电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100加入5µl染色液。

8070电泳50观察结果，在阳性对照出现468条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现468的条带，判定为病毒阳性。

高致病性猪繁殖与呼吸综合症检测程序

一、病毒的提取

1、阳性对照的提取

材料阳性对照病料为该病的活疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。

方法提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

2、疑似病料的提取

样品采集病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。

附：

通常木乃伊胎不能作为检测样品。

对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。

对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。

胎儿的保存方法同上。

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心5，取上清液用于的提取；

全血样品处理：

待血凝后取血清用于的提取。

提取待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

二、反应

1、材料试剂盒（日本东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。

引物序列：

F：

5’3’,18，为55.56。

R：

5’--3’,18，为61.11。

扩增的目的片段为230。

2、体系及反应程序：

名称

弱毒疫苗阳性对照

检测病料

水

6µl

0

特异性下游引物

1µl

1µl

模板

5µl

11µl

12µl

12µl

置于仪上65℃10，立即冰浴5。

然后加入以下试剂：

变性后的溶液

12µl

5×

4µl

2µl

1µl

1µl

20µl

按以下程序反转录：

1、42℃，45

2、99℃,5

将-20℃保存。

1、反应体系及程序

2O

7.5µl

3µl

上游引物

1µl

下游引物

1µl

2×

12.5µl

25µl

反应程序：

1、94℃，3

2、95℃，30

3、52℃，30×35

4、72℃，1

5、72℃，10

三、电泳

用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100加入5µl染色液。

8070电泳40观察结果，在阳性对照出现230条带，阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现230的条带，判定为高致病性病毒阳性。

猪流行性乙型脑炎检测程序

一、病毒的提取

1、阳性对照的提取

材料阳性对照病料为该病的弱毒疫苗、检测用病毒提取试剂盒（天跟公司产品）。

方法提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

2、疑似病料的提取

样品采集采集病死或扑杀的猪，取血液、腹股沟淋巴结、脑脊髓液、死产胎儿的脑组织、分泌物、脾、肿胀的睾丸等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。

附：

通常木乃伊胎不能作为检测样品。

对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。

对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。

胎儿的保存方法同上。

组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5生理盐水继续研磨，匀浆后-20℃反复冻融3次，转至1.5灭菌离心管中，8000离心2，取上清液用于的提取；全血样品处理：

待血凝后取血清用于的提取。

提取待检样品的提取按试剂盒说明进行，最后用50µl水溶解，得到溶液。

三、反应

1、材料试剂盒（东洋纺产品）、试剂盒（天跟公司产品）。

引物序列：

F：

5’3’,18，为59.58。

R：

5’-3’,20，为57.8。

扩增的目的片段为238。

1、体系及反应程序：

名称

弱毒疫苗阳性对照

检测病料

水

6µl

0

特异性下游引物

1µl

1µl

模板

5µl

11µl

12µl

12µl

置于仪上65℃10，立即冰浴5。

然后加入以下试剂：

变性后的溶液

12µl

5×

4µl

2µl

1µl

1µl

20µl

按以下程序反转录：

1、42℃，45

2、99℃,5

将-20℃保存。

2、反应体系及程序

2O

7.5µl

3µl

上游引物

1µl

下游引物

1µl

2×

12.5µl

25µl

反应程序：

1、94℃，3

2、95℃，30

3、53℃，30×35

4、72℃，1

5、72℃，10

三、电泳

用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100加入5µl染色液。

8070电泳40观察结果，在阳性对照出现238条带、阴性对照无条带出现的情况下，检测样品如出现238的条带，判定为猪流行性乙型脑炎病毒阳性。

猪伪狂犬病毒（）检测程序

一、基因组提取及扩增

1、材料与试剂提取试剂盒，试剂盒购自天跟公司。

引物F：

5’3’18，为59.58。

R：

5’--3’19，为59.72。

扩增的目的片段为324。

2、的提取

2.1样品采集病死或扑杀猪，取血液、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿、神经系统如大脑等组织；待检活猪，用注射器取血5，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。

附：

通常木乃伊胎不能作为检测样品。

对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。

对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。

胎儿的保存方法同上。

2.2组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心5，取上清液用于的提取；

全血样品处理：

待血凝后取血清用于的提取。

2.3的提取按试剂盒说明进行。

二、扩增

反应体系及程序：

2O

7.5µl

3µl

上游引物

1µl

下游引物

1µl

2×

12.5µl

25µl

反应程序：

1、94℃，3

2、95℃，30

3、56℃，30×35

4、72℃，1

5、72℃，10

三、电泳

用电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100加入5µl染色液。

8070电泳40观察结果，在阳性对照出现324条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现324的条带，判定为阳性。

猪细小病毒（）检测程序

一、基因组提取

1、材料与试剂提取试剂盒，试剂盒购自天跟公司。

引物：

F：

5’3’22，为58.21。

R：

5’-3’21，为58.01。

扩增的目的片段为471。

2、的提取

2.1样品采集70日龄以内流产或产死胎儿的新鲜脏器（脑、肾、肝、肺、睾丸、胎盘及肠系膜淋巴结）等，其中以肠系膜淋巴结和肝脏的分离率最高，母猪的胎盘和阴道分泌物。

2.2组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心5，取上清液用于的提取；

全血样品处理：

待血凝后取血清用于的提取。

2.3的提取按试剂盒说明进行。

二、扩增

反应体系及程序：

2O

7.5µl

3µl

上游引物

1µl

下游引物

1µl

2×

12.5µl

25µl

反应程序：

1、94℃，3

2、95℃，30

3、56℃，30×35

4、72℃，1

5、72℃，10

三、电泳

用电泳缓冲液配制1.2%的琼脂糖凝胶，100加入5µl染色液。

8070电泳40观察结果，在阳性对照出现471条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现471的条带，判定为阳性。

猪圆环病毒Ⅱ型

（2）检测程序

二、基因组提取及扩增

1、材料与试剂50的溶液、1M（8.0）、扩增试剂盒（东洋纺产品）。

引物：

F：

5’3’20，为57.3。

R：

5’-3’20，为55.75。

扩增的目的片段为250。

2、的提取

2.1样品采集取血液、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏等组织病变与健康部交界处组织（圆环病毒检测必须包括淋巴结样品）；待检活猪，用注射器取血5，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。

2.2样品处理

组织样品处理：

称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5继续研磨，匀浆后转至1.5灭菌离心管中，8000离心5，取上清液用于的提取；

全血样品处理：

待血凝后取血清用于的提取。

二、扩增

反应体系及程序：

2O

7.5µl

3µl

上游引物

1µl

下游引物

1µl

2×

12.5µl

25µl

反应程序：

1、94℃，3

2、95℃，30

3、53℃，30×35

4、72℃，1

5、72℃，10

三、电泳

用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，100加入5µl染色液。

8070电泳40观察结果，在阳性对照出现250条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现200多的条带，判定为2阳性。

细菌学检测程序

是一种多形态、非溶血性、不运动、依赖性的革兰氏阴性细小杆菌。

大小为1.5*（0.3~0.4），多单个、也有短排排列，新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可成短链，并可形成荚膜，在陈旧培养物上呈多形态。

无鞭毛、芽胞，美蓝染色呈两极。

需氧或兼性厌氧，最适生长温度35℃~37℃，7.6~7.8。

初次分离培养时供给5102可促进生长，本菌培养需V因子或也可满足要求。

实验室使用血琼脂培养基中含有X因子及V因子，但血液中的V因子通常处于被抑制状态，通常不能在含有完整红细胞的血琼脂上生长，血液加热后，细胞膜上的抑制物被破坏，V因子释放，实验室分离通常使用巧克力琼脂培养基。

在巧克力琼脂平板上经37℃24~48小时培养，生长的菌落呈圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、灰白色半透明的菌落，在马血琼脂平板上（加了）生长良好，划线接种在有葡萄球菌的血平板上24小时后呈现卫星生长，在划线周围菌落生长良好（现象），远离葡萄球菌的菌落较小。

由于金黄色葡萄球菌等产色素的细菌及酵母菌，在生长过程中可合成V因子，并在培养中扩散，所以出现此现象[1]。

本菌对外界的抵抗力不强。

干燥环境中易死亡，60℃5~20被杀死；4℃中一般只能存活7~10天；常用消毒剂都易杀死；对结晶紫、杆菌肽、红霉素、林可霉素、卡那霉素、磺胺等药物敏感，已发现耐药菌株。

1.2流行病学

是猪上呼吸道的常在菌，能从健康动物的鼻腔、鼻分泌物、气管和扁桃体中分离到。

只感染猪，主要危害2周龄至4月龄的猪只，特别是断奶前后和保育期仔猪多发。

通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在l0％～15％，死亡率可达50%。

人工感染猪后引起多浆膜炎以及多关节炎等。

主要存在于猪的上呼吸道（鼻腔、扁桃体和气管前段等）内，通过猪群间的接触和空气飞沫以及污染物而传播。

带菌猪和感染猪为本病的传染源[2]。

2007年等[3]在欧洲从野猪身上分离出，这是首次报道's病发生在野猪，究竟是野猪感染后传染到家猪，还是家猪感染后传染到野猪身上，还有待研究。

等[4]（1997）研究表明，从鼻腔中部分离的副猪嗜血杆菌与急性化脓性鼻炎、鼻腔和气管粘膜的急性细胞肿胀以及纤毛丢失有关。

常和猪流行性感冒、圆环病毒、蓝耳病、链球菌、伪狂犬病、弓形体、附红细胞体等混合感染，但具体还不清楚是继发感染还是触发因子，目前正处于研究阶段。

培养基配制：

1.培养基：

胰蛋白胨17g；酵母提取物6g；葡萄糖2.5g；、氯化钠5g；磷酸氢二钾2.5g；大豆胨3g，双蒸水1000，调7.2-7.6。

121℃，15灭菌。

待培养基冷却至50℃，加入2.5过滤除菌后的（0.01g）与5%牛血清。

2.培养基：

胰蛋白胨17g；酵母提取物6g；葡萄糖2.5g；、氯化钠5g；磷酸氢二钾2.5g；大豆胨3g；琼脂15g，双蒸水1000，调7.2-7.6。

121℃，15灭菌。

待培养基冷却至50℃，加入2.5过滤除菌后的（0.01g）与5%牛血清。