克隆载体与表达载体.docx

1、克隆载体与表达载体根本性质根本特征或成体的构建原理机制常用的载体质粒载体质粒能利用寄主细胞的1 具有适宜的复制起始位点 ORI当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后,受体pSC101DNA复制系统进行自2具后适宜的选择性标记基因 3菌才能生长.不带用抗菌素抗性基因的殳体菌小能ColE1主复制；不相容性；可假设干限制性内切酶的单一位点 4具在含有抗菌素的培养基 选择培养基中生长.抗pBR322克转移性基因工程中米后较小的分十里和较图的拷贝数.菌系选择原埋pUC18隆用非接合性质粒pUC19载TA载体体噬 入噬其DNA两端的5末端1基因组大小；去除非必需区,建立外1通过裂解过程增殖载体 2载体与外

2、源DNA的酶插入式载体菌 菌体各带有12个碱基的互源DNA片段的克隆或替换位点 2在切3外源DNA与载体的连接 4重组噬菌体的体体补单链,即cos位点.DNA的非必需区插入选择标记： lacZ外包装5包装噬菌体颗粒的感染 6筛选入噬菌体置换型载体载有可替代区,即非必需基因；基因 c 1 失活CI基因：溶源载体的克隆原理取代型载体区.用外源DNA片段过程限制基因；Spi筛选野生型 入体替代这个区域,不会影噬菌体在带后 P2原噬菌体的溶源性响噬菌体颗粒的形成.E.coli中的生长会受到限制的表型,称作Spi+ ,即对 P2噬菌体的干扰敏感MM13噬菌体的基因组基因间隔区intergenic reg

3、ion, IG 区1、以+ 链DNA为摸板,合成互补链,M13mpn13为单链 DNA.噬菌体基因II与基因IV之间存在一段 507bp该双链称复制型 DNA RFDNA .2、RFDNA 在n代表系列数噬菌颗粒的大小受其 DNA的基因间隔区,内含有复制起始位点,宿主细胞内能快速增殖,可增加到每个细胞约 200字 对体载端点制约的,不存在包是实施改造、构建人工载体的重点区个拷贝.3、单链特异的DNA结合蛋白结合在+M13mp1 的体装限制.只感染雄性大域.IG区内只有一个 Bsu I切点.链上,从而阻断了其互补链,即链的合成,改良加上常肠杆菌2参加酶切位点,在IG区内参加单这样,细胞就会不断的

4、合成+链DNA 4、游离用的酶切位一内切酶位点.M13mpi 在IG区内插出来的+ 链DNA先与基因V的编码产物形成点 .入一个大肠杆菌的 LacZ-肽序列.特异的DNA-蛋白质复合物,然后转移到寄主细胞M13mp2 :使克隆的DNA片段以特定单链的形式膜,同时基因V的蛋白质从+ DNA链上脱落下LacZ 5 端输出受体细胞外,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生来,余下的 M13 +链DNA那么是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中,被外壳蛋白包装成的第13个核甘酸G突变长缓慢,形成混浊斑,易于识别挑选.病毒颗粒的. M13噬菌体产生单双链 DNA的成A,产生了而且重组分

5、子越大,混浊斑的混浊度亦机制一个 EcoR I越大 但M13-DNA 载体的最大缺陷是切点装载量小,只有 1.5 kb噬考斯质粒是一类人工构粘粒cosmid 是带后 cos序列的质设计构建的柯斯质粒一般长 46kb.其上的cos菌建的含有入-DNA cos 序粒.cos序列是 噬菌体DNA中将位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白.凡体-列和质粒复制子的的特DNA包装到噬菌体颗粒中所需的具有cos位点的任何 DNA分子只要在长度相当于质黏粒殊类型载体.能像DNA序列.黏粒的组成包括质粒复制噬菌体基因组,就可以向外壳蛋白结合而被包装成粒载体-DNA 那样进行体外包起点colE1 ,抗性标记am

6、p r, cos类似噬菌体入的颗粒.因此,插入柯斯质粒的外源杂装,并高效转染受体细位点,因而能象质粒一样转化和增殖.DNA可大于40kb .重组的柯斯质粒可象噬菌体入合胞；能像质粒那样在受克隆的最大 DNA片段可达45kb .一样感染大肠杆菌,并在细菌细胞中复制.载体细胞中自主复制具有有的粘粒载体含有两个 cos位点,在体较高容量的克隆水平：45kb ;具有与同源性序列的质粒进行重组的能力某种程度上可提升使用效率.能像质粒那样在受体细噬菌粒载体综合了质粒载体和 M13噬1.具有较小分子量基因组 DNA ,可克隆10kb的pUC118和胞中自主复制能像菌体载体优点,含有 ColEl复制起始位外源

7、DNA片段,并易于进行别离与操作； 2.编码pUC119M13-DNA 那样体外包点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌一个amp基因作为选择记三, 便于转化子的选择；装,并高效转染受体细体DNA间隔区含有噬菌体 DNA复制3.拷贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区,因噬菌胞装载量比常规的起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所此多种不向类型的外源 DNA片段,不经修饰便可M13mp 系列要大很多必需的全部顺式作用元件直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大体10 kb通过克隆双链它具有质粒的复制起点、选择性标记、肠杆菌lacZ基因的5-端编码区,可根据IPTG显DNA能获得同等长度多克隆位点等,

8、方便 DNA的操作,可色反响试验筛选 6. lacZ基因是置于lac启动子的控的单一单链DNA在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体制之下,插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式重组操作简便,筛选容的复制起点,在辅助噬菌体的存在下,表达；7含有质粒的复制起点,可复制形成大量的易可进行噬菌体的繁殖,产生单链的子代噬菌体双链DNA分子8.带一个M13噬菌体的复制起点,在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中,可以合成出单DNA拷贝,并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9.;在pUC118 和pUC119 这两个载体中,多克隆位点区的核甘酸序列取向是彼此相反的,于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链 DNA,另一个那么

9、可转录出负链 DNA人工染色体染色体具有复制功能,利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌 体和噬菌体-质粒杂台载体等后很大的 拓展,甚至可以跟染色体的大小相媲美.人工染色体载体拷贝数少,制备困难,通常采取“穿梭载体的策略来解决含有质粒载体所必备的第一受体大肠杆菌质粒复制起始位点,这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制, 含有第二受体如酵母端粒TEL、DNA复制起始位点 ARS和着丝粒CEN以及适宜的选择标记.载体在体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞,根据染色体复制的形式进行复制和传递. 筛选ITT体的克隆一酵

10、母人工染色体载体YAC细菌人工染色体载体BACP1噬菌体人般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型.工染色体载体PAC质粒载体总结长度选择标记克隆位点天然质粒,属严紧型、低拷贝型9.09四划、素抗性7 个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、pSC101kbTetrBamH I、Sal I、Sam I主要使用EcoR I天然质粒,属松弛型多拷贝型6.3 kb大肠杆菌素EcoR I位于E1内部,插入外源DNA会导致E1质(colicin ) E1失活,使受体菌不能合成 E1 ColE1-,但仍然ColEI粒和对E1免疫的表现出对 E1

11、免疫型ImmE1 +载基因immE1 体兀件来源复制起点 orip4363b基卜日每系和24个克隆位点.MB1系列来源于ColEI 的高拷贝型复制起点p四环素抗性其中9个会导致Tetr基因失活如 BamH I、pBR322Amp r基因 pSP2124 质粒的 Amp r基因Tetr基因Hind m、Sal I);pSC101 的 Tetr 基因.3个会导致 Amp r基因失活Sca I、PvuI、Pst I .pUC系歹Ui来自pBR322质粒的复制起点ori; ii氨节青2.7kbAmpicillin 抗10个连续的单一限制酶切位点,位于 lacZ 基霉素抗性基因ampr ,但它不再含后原

12、来的核酸内切性和lacZ的因的5端.限制酶的单识别位点； iii大肠杆菌3 -半乳糖酶基因lacZ的启动子及其编码“-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ 基因；iv位于lacZ 基因中的靠近5 -端的一段多克隆位点MCS区段,但它并不破坏该基因的功能a肽互补蓝白斑相结合.TA载体耐热聚合酶可在 PCR广物的3端加上一个非配对的脱氧腺喋吟核甘A.根据这一特点研制出线性 TA质粒载体,其5端各带一个不配对的脱氧胸腺喀咤T,用该载体可进行 PCR产物的直接克隆.TA载体构建：在一般质粒载体的根底上构建.方法1 :先采用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化,再通过 Klenow片段将酶切的线性载体

13、末端补平方法2：利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端,最后将线性化钝末端质粒载体加T反响形成.目前有很多公司推出了 TA质粒载体.X噬菌体载体分类入噬菌体载体插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体入噬菌体载体相对于质粒载体来说,克隆片段较大,所以一般用于 cDNA文库或基因组文库的构建.cl基因插入失沽：如入 gt10、入NM1149 等载体,在 cl基因上有 EcoR I及Hind III的酶切位点.外源基因 插入后将导致cI基因的失活.cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化,产生清楚的噬菌斑.相反,产生混浊的 噬菌斑.Lac Z基因插入失活：如 charon

14、16A 载体,在非必须区段引入 lac Z基因,在lac Z基因上有 EcoR I位点, 插入失活后利用X-gal法筛选蓝白筛选置换型载体取代型载体具有成对的克 隆位点,在这 两个位点之间 的入DNA区段 可以被外源DNA片段所取 代.野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的,外源 DNA可以取代这一片段这些载体是用Lac 5替换入噬菌体的中间区段,同时将 Lac 5作为选择标记使用时用EcoRI水解,去掉中间的片段,再与欲克隆片段在体外进行重组、 包装.而后,感染E.coli使之在E.coli内繁殖,并裂解 E.coli,形成空斑.置换型入噬菌体是使用最广泛的载体.人 工 染

15、 色体类别元件优点酵母人工染色体载体YAC是最常用来克隆很大DNA片段(2Mb )的系 统.为构建YAC需要结合四个短序列：即二个端粒、 一个着丝粒和一个 ARS元件,并将一适当大小 的外源DNA连接成一线性 DNA分子,而端粒 序列位于正确的末端.YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点, 由于某些真核细胞的序列,特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中繁殖的,酵母细胞却具有这样的水平细菌人工染色体载体BAC是基于大肠杆菌的F质粒构建的,高通量低拷贝的质粒载体每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记,一个来源于大肠杆菌 F因子(致育因子)的严谨型限制的复制子 oriS ( Shizuya et

16、 al.1992 ), 一个易于 DNA 复制的由 ATP驱动以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建 BAC文库比YAC文库更容易；BAC载体以环型超螺旋状态存在, 从大肠杆菌中提取质粒较方便,川从酵母中分禺 DNA较困难；BAC的复制子来源于F因子,可稳定遗传,嵌合及重组的解旋酶RepE以及三个保证低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 parA ,parB ,和 parC 现象少；可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因,方便快捷；BAC载体在克隆位点的两侧具有 T7和Sp6聚合 酶启动子,可以用于转录获得 RNA探针或直接用于插入片段的末端测序.表达载体分类结构组成及表达元件特点或优点备注质原核表达载

17、1启动子、表达方式后:启动子类型：根据作用方式及功能分类 组成粒体2转录终止子预防克隆的外源基因表达干组成型表达,型启动子表扰载体的稳定性诱导型表达.组织特异启动子又称器官特异性启动子.达3核糖体结合位点融合型表达,诱导型启动子载体分泌型表达.酵母表达载体来自pBR322根本骨架含有该质粒复制起 始位点(ori) , lacZ 基因、bla 或 amp r、tetr 等基因.含有 URA3、HIS3、LEU2、TRPI、 LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛 选或禾用 zeocin 、basticidin (杀稻MWS) 的抗性基因筛选.启动子有 GAP、AOXl、 AUGl 和 GAL1

18、 等.GAP是组成型启动子.其余是诱导型启动子.酵母表达载体多为穿梭载体：既可以在大肠杆菌中繁殖,获得足够的载体DNA进行体外操作,又可以在酵母中复制、表达和选择.融合蛋白表达载体： 于外源基因插入位点的 C端或N端插入了1个6 XHis标签,或在5端插入了 - -因子作为分泌信号由于原核生物和真核生物存在糖基化、 酰基化 等译后修饰反响机制的差异, 真核基因的原 核表达难以获得有活性的蛋白. 酵母成为真核 表达的首选系统.Ti质粒表达一元载体一兀载体就是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体(Ti质粒)通过同源重组所产生的一种复合型载体,也称为共整合载体.由于建体的 T-DNA区与Vir区紧

19、密连锁,也称为顺式载体 (cis-vector)Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植物产生冠瘤瘤的质粒.根据冠瘤瘤合成的冠瘤碱种类,Ti质粒可分为章鱼碱、农杆碱、农杆菌素和琥珀碱 4种不同类型Ti质粒可分为 T-DNA、Vir、Con和Ori 4构建的根本原理：引入分子质量较小的中间载体, 将欲转化的目的基因及抗性标记基因构建到中间载体上.将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉,仅保存具两边界及与 T-DNA 转移所必需的载体个功能区.T-DNA区是Ti质粒中能转移到植物细胞内的区域. Vir区 位于T-DNA 区的上游,其表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移,这一个区域也称为致病区.C

20、on区该区含有与农杆菌之间接合转移后关的基因(tra ),这些基因受佰主细胞合成的冠痹碱激活,使 Ti质粒在细菌之间转移.Ori区 调控Ti质粒的自我复制,为复制 起始区25个碱基序列,构建成所谓卸甲载体.在卸甲载体的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入中间载体同源的质粒序列, 将中间载体转入含有卸甲载体的根癌农杆菌中, 构建在中间载体上目的基因可通过向源重组整合到卸甲载体Ti质粒的T-DNA 区,并与卸甲载体 Ti质粒一起复制.二元载体双元表达载体系统主要包括两个局部： 一局部为卸甲Ti质粒,这类Ti质粒由于缺失 了 T-DNA区域,完全丧失了致瘤作用, 主要是提供Vir基因功能,激活处于反式

21、位 置上的T-DNA的转移.另一部份是 微型Ti质粒,它在T-DNA左右边界序列之间 提供植株选择标记如 NPTII基因以及Lac Z双元载体系统的卞建的原理是 Ti质粒上的Vir基因可以反式激活 T- DNA的转移.与共整合载体所不同的是, 它不依赖两个质粒之间的同源序列,不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制双元表达载体构件方便,转化效率高于一元载体.基因等.病杆状病是表杆状病毒表达系统的根本兀件：重组蛋白具后完整的生物学功能： 接近杆状病毒科病毒,杆状病毒颗粒,双链闭合环毒达载体(1)启动子：多个启动子同时表达多个外源天然蛋白.能进行译后的加工修饰：状DNA病毒,专一性感染无脊椎动物表基

22、因.(2)poly A加尾彳百号：(3)同源重组研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方将外源基因先克隆到转移载体上,再与病毒基达序列.(4)穿梭载体必需元件.除带有病毒面的理想模型.表达水平高：最局可使因组共同转染细胞,通过细胞内的同源重组获载自身的复制起始位点外,还带有 pUC质粒目的蛋白的量到达细胞总蛋白的 50 %.得带有外源基因的重组病毒的策略.体的复制子及以ampr,可以在细菌内进行扩能容纳大分子的插入片段：上限未知.增.(5)筛选标记.能同时表达多个基因： 在同一细胞内同时表达多个基因.能表达基因组DNA :昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能.对重组蛋白进行定位的功能： 如将核蛋白转送

23、到细胞核上,膜蛋白那么定位在膜上,分泌蛋白那么可分泌到细胞外等.腺病母载体腺病毒DNA末端结构突出特点 1)带有腺病毒载体是目前最为、泛应用的基因首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转100bp反向的末端重复序列ITR,而且在载体,也是唯一基因约物的载体双链移质粒,该质粒含有病毒基因组某段早期序每一条单链的 5-末端还共价地连接着末DNA的分子大小约为 36kb.歹U;然后将一个含有启动于一外源基因 -poly端结合蛋白,对病毒的复制有重要作用.2口应附于1.基因治疗2.表达真核基因3.A的表达盒插入到上述质粒中腺病毒 E1、E3当它从病毒颗粒中别离出来之时, 便会自发研制疫苗或E4至右侧的I

24、TR区之间,构建成载有外源地环化起来,此后许多环形分子又聚合成多基因的穿梭质粒.聚体反泡沫从5端开始依次是：5长末端重复序一类含单链RNA的动物病毒.它的基因载体的构建：转病毒列5 -LTR,带有增强子和启动子序列；组含有2条相同的正链 RNA分子,包装别离原病毒DNA 一删去局部序列一组入选择录类psi序列,又称少序列,是病毒包装所必成二倍体病毒颗粒.1在大多数情况下,性标记基因、目的基因和调控兀件一克隆到含病慢病须的彳百号序列；gag ,编码病毒衣壳蛋白；反转录病毒的肿瘤基因 onc都能够在正有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体一转化毒母失pol ,编码反转录酶和整合酶 Int；常的细胞中转录

25、.2反转录病毒的寄主大肠杆菌一获得反转录病毒克隆载体一 辅助载致癌env,编码病毒颗粒外层包装蛋白； 3范围相当广,包括无脊椎动物和脊椎动细胞系包装细胞系一扩增体病毒长末端重复序列3 -LTR,带有poly A加物.3反转录病毒具有强启动子,外源类尾信号序列.基因可得到启效表达. 4 反转小病是不但感染效率高,而且不招致寄主细胞的死亡SV40病毒型转化载体根据SV40 DNA进入敏感动物细胞的转方 向,分为早期转录区和晚期转录区.早期转录区包括与病毒感染相关的 t抗原基因(small T-antigen) 和 T 抗原基因(large T-antigen) 等；含有 BamHI 等限制性内切核

26、酸酶识别位点；晚期转录区包括与病毒壳蛋白合成相关的基因,含有 EcoRi等限制性内切核酸酶识别位点.含有能够被真核细胞识别的有效的启 动子.有许多种动物病毒,在其感染周 期中都能够持续地复制,使其基因组拷贝 数到达相当高的水平.有些动物病毒具 有限制自己复制的顺式元件和反式作用 因子.有些动物病毒,在它们的复制过 程中能高效稳定地整合到寄主核基因组 上.病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接 及器.用病毒外壳蛋白质包装重组质粒 DNA形成的假病毒颗粒,即构成了一种 高效的转化体系猿猴空 泡病毒 40(Simian vacuolatingvirus 40, SV40)基因组是一种环形双链的DNA ,其大小仅有 5243bp ,很适于基因操作.导致人体癌变的可能性极低, 对人体是安全的.一些质粒型表达载体带有来自SV40DNA的个别调控区,位于病毒的早期与晚期转录单位之间,包括 1、DNA复制起始位点2、早期与晚期 mRNA转录的起始位点3、能激活复制起始位点并可自动调节早期转录的