克隆载体与表达载体.docx
《克隆载体与表达载体.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《克隆载体与表达载体.docx(30页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![克隆载体与表达载体.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2023-2/21/ebaea00e-5c08-44e9-88e9-e67ad3c1b44d/ebaea00e-5c08-44e9-88e9-e67ad3c1b44d1.gif)
克隆载体与表达载体
根本性质
根本特征〔或成体的构建〕
原理机制
常用的载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的
〔1〕具有适宜的复制起始位点〔ORI〕
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后,受体
pSC101
DNA复制系统进行自
〔2〕具后适宜的选择性标记基因〔3〕
菌才能生长.不带用抗菌素抗性基因的殳体菌小能
ColE1
主复制;不相容性;可
假设干限制性内切酶的单一位点〔4〕具
在含有抗菌素的培养基〔选择培养基〕中生长.〔抗
pBR322
克
转移性〔基因工程中米
后较小的分十里和较图的拷贝数.
菌系选择原埋〕
pUC18
隆
用非接合性质粒〕
pUC19
载
TA载体
体
噬入噬
其DNA两端的5'末端
〔1〕基因组大小;去除非必需区,建立外
1〕通过裂解过程增殖载体2〕载体与外源DNA的酶
插入式载体
菌菌体
各带有12个碱基的互
源DNA片段的克隆或替换位点〔2〕在
切3〕外源DNA与载体的连接4〕重组噬菌体的体
体
补单链,即cos位点.
DNA的非必需区插入选择标记:
lacZ
外包装5〕包装噬菌体颗粒的感染6〕筛选〔入噬菌体
置换型载体
载
有可替代区,即非必需
基因;基因c1失活〔CI基因:
溶源
载体的克隆原理〕
〔取代型载
体
区.用外源DNA片段
过程限制基因〕;Spi筛选〔野生型入
体〕
替代这个区域,不会影
噬菌体在带后P2原噬菌体的溶源性
响噬菌体颗粒的形成.
E.coli中的生长会受到限制的表型,称
作Spi+,即对P2噬菌体的干扰敏
感〕
M
M13噬菌体的基因组
基因间隔区〔intergenicregion,IG区〕
1、以〔+〕链DNA为摸板,合成互补〔―〕链,
M13mpn
13
为单链DNA.噬菌体
基因II与基因IV之间存在一段507bp
该双链称复制型DNA〔RFDNA〕.2、RFDNA在
n代表系列数
噬菌
颗粒的大小受其DNA
的基因间隔区,内含有复制起始位点,
宿主细胞内能快速增殖,可增加到每个细胞约200
字②对
体载
端点制约的,不存在包
是实施改造、构建人工载体的重点区
个拷贝.3、单链特异的DNA结合蛋白结合在〔+〕
M13mp1的
体
装限制.只感染雄性大
域.②IG区内只有一个BsuI切点.
链上,从而阻断了其互补链,即〔―〕链的合成,
改良加上常
肠杆菌
〔2〕参加酶切位点,在IG区内参加单
这样,细胞就会不断的合成〔+〕链DNA4、游离
用的酶切位
一内切酶位点.M13mpi在IG区内插
出来的〔+〕链DNA先与基因V的编码产物形成
点.
入一个大肠杆菌的LacZ'〔-肽序列〕.
特异的DNA-蛋白质复合物,然后转移到寄主细胞
M13mp2:
使克隆的DNA片段以特定单链的形式
膜,同时基因V的蛋白质从〔+〕DNA链上脱落下
LacZ'5'端
输出受体细胞外,M13重组分子筛选简
便,被M13噬菌体感染的受体细胞生
来,余下的M13〔+〕链DNA那么是从其感染的寄
主细胞的细胞膜溢出的过程中,被外壳蛋白包装成
的第13个核
甘酸G突变
长缓慢,形成混浊斑,易于识别挑选.
病毒颗粒的.〔M13噬菌体产生单双链DNA的
成A,产生了
而且重组分子越大,混浊斑的混浊度亦
机制〕
一个EcoRI
越大但M13-DNA载体的最大缺陷是
切点
装载量小,只有1.5kb
噬
考斯质粒是一类人工构
粘粒〔cosmid〕是带后cos序列的质
设计构建的柯斯质粒一般长4〜6kb.其上的cos
菌
建的含有入-DNAcos序
粒.cos序列是噬菌体DNA中将
位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白.凡
体-
列和质粒复制子的的特
DNA包装到噬菌体颗粒中所需的
具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于
质
黏粒
殊类型载体.能像
DNA序列.黏粒的组成包括质粒复制
噬菌体基因组,就可以向外壳蛋白结合而被包装成
粒
载体
-DNA那样进行体外包
起点〔colE1〕,抗性标记〔ampr〕,cos
类似噬菌体入的颗粒.因此,插入柯斯质粒的外源
杂
装,并高效转染受体细
位点,因而能象质粒一样转化和增殖.
DNA可大于40kb.重组的柯斯质粒可象噬菌体入
合
胞;能像质粒那样在受
克隆的最大DNA片段可达45kb.
一样感染大肠杆菌,并在细菌细胞中复制.
载
体细胞中自主复制具有
有的粘粒载体含有两个cos位点,在
体
较高容量的克隆水平:
45kb;具有与同源性序
列的质粒进行重组的能
力
某种程度上可提升使用效率.
能像质粒那样在受体细
噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬
1.具有较小分子量基因组DNA,可克隆10kb的
pUC118
和
胞中自主复制能像
菌体载体优点,含有ColEl复制起始位
外源DNA片段,并易于进行别离与操作;2.编码
pUC119
M13-DNA那样体外包
点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌
一个amp基因作为选择记三,便于转化子的选择;
装,并高效转染受体细
体DNA间隔区〔含有噬菌体DNA复制
3.拷贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区,因
噬菌
胞装载量比常规的
起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所
此多种不向类型的外源DNA片段,不经修饰便可
M13mp系列要大很多
必需的全部顺式作用元件〕
直接插入到载体分子上;5.多克隆位点区阻断了大
体
〔10kb通过克隆双链
它具有质粒的复制起点、选择性标记、
肠杆菌lacZ基因的5'-端编码区,可根据IPTG显
DNA能获得同等长度
多克隆位点等,方便DNA的操作,可
色反响试验筛选6.lacZ基因是置于lac启动子的控
的单一单链DNA
在细胞内稳定存在;又具有单链噬菌体
制之下,插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式
重组操作简便,筛选容
的复制起点,在辅助噬菌体的存在下,
表达;7含有质粒的复制起点,可复制形成大量的
易
可进行噬菌体的繁殖,产生单链的子代
噬菌体
双链DNA分子8.带一个M13噬菌体的复制起
点,在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中,可以合成
出单DNA拷贝,并包装成噬菌体颗分泌到培养基
中;9.;在pUC118和pUC119这两个载体中,多
克隆位点区的核甘酸序列取向是彼此相反的,于是
它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA,另一
个那么可转录出负链DNA
人工染色
体
染色体具有复制功能,
利用染色体的复制元件
来驱动外源DNA片段
复制的载体称为人工染
色体载体
其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂台载体等后很大的拓展,甚至可以跟染色体的大小相媲美.
人工染色体载体拷贝数少,制备困难,
通常采取“穿梭载体〞的策略来解决
含有质粒载体所必备的第一受体〔大肠杆菌〕质粒复
制起始位点,这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒
复制形式进行高拷贝复制,含有第二受体〔如酵母〕
端粒〔TEL〕、DNA复制起始位点〔ARS〕和着丝粒
〔CEN〕以及适宜的选择标记.载体在体外与目的
DNA重组后转化到第二受体细胞,根据染色体复制
的形式进行复制和传递.筛选ITT体的克隆一
酵母人工染
色体载体
YAC
细菌人工染
色体载体
BAC
P1噬菌体人
般采用抗生素抗性选择标记;筛选第二受体的克隆
子常用与受体互补的营养缺陷型.
工染色体载
体PAC
质粒载体总结
长度
选择标记
克隆位点
天然质粒,属严紧型、低拷贝型
9.09
四划、素抗性
7个克隆位点:
EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、
pSC101
kb
Tetr
BamHI、SalI、SamI
主要使用EcoRI
天然质粒,属松弛型多拷贝型
6.3kb
大肠杆菌素
EcoRI位于E1内部,插入外源DNA会导致E1
质
(colicin)E1
失活,使受体菌不能合成E1〔ColE1-〕,但仍然
ColEI
粒
和对E1免疫的
表现出对E1免疫型〔ImmE1+〕
载
基因〔immE1〕
体
兀件来源①复制起点orip
4363b
基卜日每系和
24个克隆位点.
MB1系列〔来源于ColEI〕的高拷贝型复制起点②
p
四环素抗性
其中9个会导致Tetr基因失活〔如BamHI、
pBR322
Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因③Tetr基因
Hindm、SalI);
pSC101的Tetr基因.
3个会导致Ampr基因失活〔ScaI、PvuI、PstI〕.
pUC系歹U
〔i〕来自pBR322质粒的复制起点〔ori〕;〔ii〕氨节青
2.7kb
Ampicillin抗
10个连续的单一限制酶切位点,位于lacZ'基
霉素抗性基因〔ampr〕,但它不再含后原来的核酸内切
性和lacZ的
因的5'端.
限制酶的单识别位点;〔iii〕大肠杆菌3-半乳糖酶基因
〔lacZ〕的启动子及其编码“-肽链的DNA序列,此结
构特称为lacZ'基因;〔iv〕位于lacZ'基因中的靠近5-
端的一段多克隆位点〔MCS〕区段,但它并不破坏该基
因的功能
a肽互补〔蓝
白斑〕相结合.
TA载体
耐热聚合酶可在PCR广物的3'端加上一个非配对
的脱氧腺喋吟核甘〔A〕.根据这一特点研制出线性TA
质粒载体,其5'端各带一个不配对的脱氧胸腺喀
咤〔T〕,用该载体可进行PCR产物的直接克隆.
TA载体构建:
在一般质粒载体的根底上构建.
方法1:
先采用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化,再通过Klenow片
段将酶切的线性载体末端补平
方法2:
利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端,最后将线性化
钝末端质粒载体加T反响形成.目前有很多公司推出了TA质粒载体.
X噬菌体载体
分类
入噬
菌体
载体
插入式载体
一种只具有一
个可供外源
DNA插入的克
隆位点的派生
载体
入噬菌体载体相对于质粒载体来说,克隆片段较大,所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建.
cl基因插入失沽:
如入gt10、入NM1149等载体,在cl基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点.外源基因插入后将导致cI基因的失活.cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化,产生清楚的噬菌斑.相反,产生混浊的噬菌斑.
LacZ基因插入失活:
如charon16A载体,在非必须区段引入lacZ基因,在lacZ基因上有EcoRI位点,插入失活后利用X-gal法筛选〔蓝白筛选〕
置换型载体
〔取代型载
体〕
具有成对的克隆位点,在这两个位点之间的入DNA区段可以被外源
DNA片段所取代.
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的,外源DNA可以取代这一片段
这些载体是用Lac5替换入噬菌体的中间区段,同时将Lac5作为选择标记
使用时用EcoRI水解,去掉中间的片段,再与欲克隆片段在体外进行重组、包装.而后,感染E.coli使之在E.coli
内繁殖,并裂解E.coli,形成空斑.
置换型入噬菌体是使用最广泛的载体.
人工染色
体
类别
元件
优点
酵母人工染色体
载体
YAC
是最常用来克隆
很大DNA片段
(2Mb)的系统.
为构建YAC需要结合四个短序列:
即二个端粒、一个着丝粒和一个ARS元件,并将一适当大小的外源DNA连接成一线性DNA分子,而端粒序列位于正确的末端.
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点,由于某些真核
细胞的序列,特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中
繁殖的,酵母细胞却具有这样的水平
细菌人工染色体
载体
BAC
是基于大肠杆菌
的F质粒构建
的,高通量低拷
贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标
记,一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)
的严谨型限制的复制子oriS(Shizuyaetal.
1992),一个易于DNA复制的由ATP驱动
①以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建BAC文库比YAC
文库更容易;②BAC载体以环型超螺旋状态存在,从大肠
杆菌中提取质粒较方便,川从酵母中分禺DNA较困难;
③BAC的复制子来源于F因子,可稳定遗传,嵌合及重组
的解旋酶〔〔RepE〕以及三个保证低拷贝质
粒精确分配至子代细胞的基因座〔parA,
parB,和parC〕
现象少;④可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因,方便
快捷;⑤BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子,可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入
片段的末端测序.
表达载体
分类
结构组成及表达元件
特点或优点
备注
质
原核表达载
1启动子、
表达方式后:
启动子类型:
根据作用方式及功能分类①组成
粒
体
2转录终止子〔预防克隆的外源基因表达干
组成型表达,
型启动子
表
扰载体的稳定性〕
诱导型表达.
②组织特异启动子又称器官特异性启动子.
达
3核糖体结合位点
融合型表达,
③诱导型启动子
载
体
分泌型表达.
酵母表达载
体
来自pBR322根本骨架含有该质粒复制起始位点(ori),lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因.含有URA3、HIS3、LEU2、TRPI、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或禾用zeocin、basticidin(杀稻MWS)的抗性基因筛选.启动子有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等.
GAP是组成型启动子.其余是诱导型启
动子.酵母表达载体多为穿梭载体:
既可
以在大肠杆菌中繁殖,获得足够的载体
DNA进行体外操作,又可以在酵母中复
制、表达和选择.融合蛋白表达载体:
于
外源基因插入位点的C端或N端插入了
1个6XHis标签,或在5'端插入了--
因子作为分泌信号
由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等译后修饰反响机制的差异,真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋白.酵母成为真核表达的首选系统.
Ti
质
粒
表
达
一元
载体
一兀载体就是含目的基因的中间表达载体
与改造后的受体(Ti质粒)通过同源重组所
产生的一种复合型载体,也称为共整合载
体.由于]建体的T-DNA区与Vir区紧密
连锁,也称为顺式载体(cis-vector)
Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植
物产生冠瘤瘤的质粒.根据冠瘤瘤合成的
冠瘤碱种类,Ti质粒可分为章鱼碱、农杆
碱、农杆菌素和琥珀碱4种不同类型Ti
质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori4
构建的根本原理:
引入分子质量较小的中间载体,将欲转化的目
的基因及抗性标记基因构建到中间载体上.
将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉,
仅保存具两边界及与T-DNA转移所必需的
载
体
个功能区.T-DNA区是Ti质粒中能转
移到植物细胞内的区域.Vir区位于
T-DNA区的上游,其表达产物可激活
T-DNA向植物细胞的转移,这一个区域
也称为致病区.
Con区该区含有与农杆菌之间接合转
移后关的基因(tra),这些基因受佰主细胞
合成的冠痹碱激活,使Ti质粒在细菌之
间转移.
Ori区调控Ti质粒的自我复制,为复制起始区
25个碱基序列,构建成所谓卸甲载体.在卸
甲载体的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入
中间载体同源的质粒序列,将中间载体转入含
有卸甲载体的根癌农杆菌中,构建在中间载体
上目的基因可通过向源重组整合到卸甲载体
Ti质粒的T-DNA区,并与卸甲载体Ti质粒
一起复制.
二元
载体
双元表达载体系统主要包括两个局部:
一
局部为卸甲Ti质粒,这类Ti质粒由于缺失了T-DNA区域,完全丧失了致瘤作用,主要是提供Vir基因功能,激活处于反式位置上的T-DNA的转移.另一部份是微型
Ti质粒,它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及LacZ
双元载体系统的卞^建的原理是Ti质粒上的Vir
基因可以反式激活T-DNA的转移.
与共整合载体所不同的是,它不依赖两个
质粒之间的同源序列,不需要共整合过程就能
在农杆菌’内独立复制
双元表达载体构件方便,转化效率高于一
元载体.
基因等.
病
杆状病是表
杆状病毒表达系统的根本兀件:
①重组蛋白具后完整的生物学功能:
接近
杆状病毒科病毒,杆状病毒颗粒,双链闭合环
毒
达载体
(1)启动子:
多个启动子同时表达多个外源
天然蛋白.②能进行译后的加工修饰:
状DNA病毒,专一性感染无脊椎动物
表
基因.
(2)polyA加尾彳百号:
(3)同源重组
研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方
将外源基因先克隆到转移载体上,再与病毒基
达
序列.(4)穿梭载体必需元件.除带有病毒
面的理想模型.③表达水平高:
最局可使
因组共同转染细胞,通过细胞内的同源重组获
载
自身的复制起始位点外,还带有pUC质粒
目的蛋白的量到达细胞总蛋白的50%.
得带有外源基因的重组病毒的策略.
体
的复制子及以ampr,可以在细菌内进行扩
④能容纳大分子的插入片段:
上限未知.
增.(5)筛选标记.
⑤能同时表达多个基因:
在同一细胞内同
时表达多个基因.⑥能表达基因组DNA:
昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能.
⑦对重组蛋白进行定位的功能:
如将核蛋
白转送到细胞核上,膜蛋白那么定位在膜
上,分泌蛋白那么可分泌到细胞外等.
腺病母载体
腺病毒DNA末端结构突出特点1)带有
腺病毒载体是目前最为、泛应用的基因
首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转
100bp反向的末端重复序列〔ITR〕,而且在
载体,也是唯一基因约物的载体双链
移质粒,该质粒含有病毒基因组某段早期序
每一条单链的5'-末端还共价地连接着末
DNA的分子大小约为36kb.
歹U;然后将一个含有启动于一外源基因-poly
端结合蛋白,对病毒的复制有重要作用.2〕
口」应附于1.基因治疗2.表达真核基因3.
A的表达盒插入到上述质粒中腺病毒E1、E3
当它从病毒颗粒中别离出来之时,便会自发
研制疫苗
或E4至右侧的ITR区之间,构建成载有外源
地环化起来,此后许多环形分子又聚合成多
基因的穿梭质粒.
聚体
反
泡沫
从5'端开始依次是:
①5'长末端重复序
一类含单链RNA的动物病毒.它的基因
载体的构建:
转
病毒
列〔5'-LTR〕,带有增强子和启动子序列;
组含有2条相同的正链RNA分子,包装
别离原病毒DNA一删去局部序列一组入选择
录
类
②psi序列,又称少序列,是病毒包装所必
成二倍体病毒颗粒.〔1〕在大多数情况下,
性标记基因、目的基因和调控兀件一克隆到含
病
慢病
须的彳百号序列;③gag,编码病毒衣壳蛋白;
反转录病毒的肿瘤基因〔onc〕都能够在正
有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体一转化
毒
母失
④pol,编码反转录酶和整合酶〔Int〕;⑤
常的细胞中转录.2〕反转录病毒的寄主
大肠杆菌一获得反转录病毒克隆载体一辅助
载
致癌
env,编码病毒颗粒外层包装蛋白;⑥3'
范围相当广,包括无脊椎动物和脊椎动
细胞系〔包装细胞系〕一扩增
体
病毒
长末端重复序列〔3'-LTR〕,带有polyA加
物.3〕反转录病毒具有强启动子,外源
类
尾信号序列.
基因可得到启效表达.4〕反转小病是不
但感染效率高,而且不招致寄主细胞的死
亡
SV40病毒
型转化载体
根据SV40DNA进入敏感动物细胞的转方向,分为早期转录区和晚期转录区.
早期转录区包括与病毒感染相关的t抗原
基因(smallT-antigen)和T抗原基因
(largeT-antigen)等;含有BamHI等限制
性内切核酸酶识别位点;晚期转录区包括与
病毒壳蛋白合成相关的基因,含有EcoRi
等限制性内切核
酸酶识别位点.
①含有能够被真核细胞识别的有效的启动子.②有许多种动物病毒,在其感染周期中都能够持续地复制,使其基因组拷贝数到达相当高的水平.③有些动物病毒具有限制自己复制的顺式元件和反式作用因子.④有些动物病毒,在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上.⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接及器.用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒,即构成了一种高效的转化体系
猿猴空泡病毒40(Simianvacuolating
virus40,SV40)基因组是一种环形双链的
DNA,其大小仅有5243bp,很适于基因操
作.导致人体癌变的可能性极低,对人体是安
全的.一些质粒型表达载体带有来自
SV40DNA的个别调控区,位于病毒的早期与
晚期转录单位之间,包括1、DNA复制起始
位点2、早期与晚期mRNA转录的起始位点
3、能激活复制起始位点并可自动调节早期转
录的