化妆品中7种染发剂的检测方法起草说明及编制说明.docx

1、化妆品中7种染发剂的检测方法起草说明及编制说明附件7：化妆品中7种染发剂的检测方法（征求意见稿）1 适用范围本方法规定了化妆品中酸性紫43（CAS：224-618-7，CI 42510 ）；碱性紫14（CAS：632-99-5，CI42510）；酸性橙3（CAS：228-921-5）；碱性黄87（CAS：116844-55-4）；碱性蓝26（CAS：2580-56-5，CI44045）；碱性红51（CAS：12270-25-6）；碱性橙31（CAS：97404-02-9）7种染发剂含量的高效液相色谱测定方法。本方法适用于染发类和烫发类化妆品中碱性红51、碱性紫14、酸性紫43、碱性蓝26、碱性

2、橙31、酸性橙3、碱性黄87等7种染发剂含量的测定。2方法提要试样经甲醇超声提取后，过0.45m滤膜，采用高效液相色谱系统分离，紫外检测器或二极管阵列检测器进行检测，外标法定量。若取5.0g样品，本方法对碱性红51、碱性紫14的检出限为0.06mg/kg；酸性紫43、碱性蓝26的检出限为0.6mg/kg；碱性橙31、酸性橙3的检出限为1.2mg/kg；碱性黄87的检出限为3.0mg/kg；最低定量浓度分别为：碱性红51、碱性紫14：0.2mg/kg、酸性紫43、碱性蓝26为2.0mg/kg；碱性橙31、酸性橙3为3.5mg/kg；碱性黄87为10mg/kg。3试剂和材料除另有规定外，所用试剂均

3、为色谱纯，水为一级水。3.1 甲醇。3.2 四氢呋喃。3.3 乙酸铵：分析纯。3.4 乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54 g乙酸铵（3.3），加水至1000 mL，溶解，经0.45m滤膜过滤。3.5 染发剂标准物质：酸性紫43（Acid Violet 43，CAS：224-618-7，CI 42510 ）；碱性紫14（Basic Violet 14，CAS：632-99-5，CI42510）；酸性橙3（Acid Orange 3，CAS：228-921-5）；碱性黄87（Basic yellow 87 ，CAS：116844-55-4）；碱性蓝26（Basic Blue 26，CA

4、S：2580-56-5，CI44045）；碱性红51（Basic red 51，CAS：12270-25-6）；碱性橙31（Basic orange 31，CAS：97404-02-9）；纯度均90%。3.6 染发剂混合标准储备液（1.0 mg/mL）：分别称取7种染发剂标准物质（3.5）0.1 g（精确至0.1mg）于100 mL容量瓶中，甲醇（3.1）稀释定容。3.7 染发剂混合标准系列溶液：分别移取一定量的2种染发剂（酸性紫43；碱性紫14）标准储备液（3.6），用甲醇配制成浓度为5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0g/mL的标准系列溶液；分别移取一定量的5种染发剂（

5、酸性橙3；碱性黄87；碱性蓝26；碱性红51；碱性橙31）标准储备液（3.6），用甲醇配制成浓度为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/mL的标准系列溶液。4仪器与设备4.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2 分析天平：感量分别为0.1 mg和1.0 mg。4.3 超声波清洗器。4.4 涡旋混匀器。4.5 有机微孔滤膜：0.45m。5分析步骤5.1 样品预处理准确称取试样5.0g（精确至1mg）于25ml比色管中，加入1.0 ml四氢呋喃（3.2），再加入20ml甲醇（3.1），涡旋振荡2min，在超声提取30min后，放置至室温，用甲醇（3.1）定容，摇匀

6、，过0.45m滤膜，待测。5.2色谱参考条件色谱柱：C18柱，250mm4.6mm（内径），5m；或相当者。流动相：A相（甲醇）+B相（0.02mol/L乙酸铵（pH=4.0），梯度洗脱程序见表1。流速：1.0 mL/min柱温：30 进样量：10L检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器检测波长：碱性蓝26为616 nm；碱性红51、碱性紫14、酸性紫43为520 nm；碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3为480 nm。表1 梯度洗脱程序时间，min流动相A（%）流动相B（%）05951030702580203580205.3 测定本方法采用外标校准曲线法定量测定。以系列标准溶液浓度为横坐标，峰面

7、积为纵坐标，作标准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。6 计算试样中染发剂的含量（g/g），按式（1）计算： . (1) 式中：w试样中染发剂的含量，g/g；C试样溶液中染发剂的含量，g/mL；V提取溶液体积，mL；m样品质量，g。7 回收率和精密度多家实验室验证的平均回收率为85.2%109.2%，相对标准偏差小于6%（n=6）。8 色谱图图1 在616nm下测得碱性蓝26标准高效液相色谱图碱性蓝26标准出峰时间为30.389 min图2 在520nm下测得碱性红51、碱性紫14、酸性紫43标准高效液相色谱图标准出峰时间：碱性红51为22.383 min；碱性紫14为25.6

8、54 min；酸性紫43为30.269 min图3 在480nm下测得碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3标准高效液相色谱图标准出峰时间：酸性橙31为13.186 min；碱性黄87为22.101 min；酸性橙3为29.437min_化妆品中7种染发剂的检测方法起草说明为更好地服务化妆品安全监管，规范化妆品中禁限用物质检测技术要求，确保化妆品质量安全，2011年6月，国家食品药品监督管理局委托河北省保健食品化妆品协会开展化妆品中7种染发剂的测定 高效液相色谱法方法建立和验证工作，现就起草工作有关情况说明如下：一、起草的必要性染发剂类化合物主要作用是增加化妆品的色泽，在染发剂等各类化妆品中最常使用

9、的一类物质。根据化妆品卫生规范2007版，染发剂属于限用物质或暂时允许使用染发剂目录，具体限量水平参见规范。根据国内外报道，为了提升产品感官性能，部分企业超量使用染发剂，存在较大风险。但是，当前仅有苯二胺等染发剂组分的检测技术要求，与现实生产实际使用种类相差较多，也不能涵盖当前现实使用的在规范目录以外的品种，成为行政监管的瓶颈问题，本技术要求的开发具有紧迫性和现实意义。为此，需要建立有一种快速有效地检测化妆品中多种染发剂的方法。本标准的制定宗旨在为化妆品中7种染发剂的测定提供更为准确的实验方法，有力的支撑未来市场化妆品的监管，同时也能够体现我国化妆品检测的水平和对化妆品监管的力度。二、起草依据

10、及文献（一）化妆品卫生规范2007版.（二）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范.（三）The cosmetic Directive of Council European Communities, 76/768/EEC.（四）中国药典2010版，第二部.（五）李英、张琛. 粉状化妆品中9种有机染发剂的高效液相色谱法测定，香精香料化妆品，2009,12（6）：29-33.（六）孙小颖、李英. 高效液相色谱法同时测定化妆品中的9种水溶性染发剂，色谱，2009,27（6）：852-855.（七）郭桂媛、林维宣. 高效液相色谱法同时测定化妆品中的4种禁用染发剂，日用化学工业，2011，41

11、（3）：229-231.（八）Rastog I S C, Baiwick V J. Identification of organic colorants in cosmetics by HPLC-Diodearray detection. Chromatographic, 1997,(45):215-228.三、起草原则本检测方法兼具先进性、准确性以及可操作性强的特点，采用目前一般检测实验室普遍具备的分析技术，选择适宜、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的精确性和重现性。四、起草过程依据国家食品药品监督管理局检验方法起草的有关要求，参考国家标准起草规范，该方法起草共分六个阶段：1、任

12、务下达。 2011年6月，正式获批开展化妆品中7种染发剂的测定 高效液相色谱法方法建立和验证工作，项目组查阅了国内外相关技术标准和文献资料，调研了国内主要省区的行业情况；2、方法开发。2012年5月，完成了该方法的建立工作；3、专家论证。2012年6月，邀请食品、化妆品、质监等相关行业专家，对方法的可行性和实用性等技术指标以及资料完整性等进行了论证，专家一致认为该方法准确、简捷、可行，适用于作为标准化的检验方法；4、方法验证。2012年7月，组织了方法验证单位（河北省药包材所、河北省疾控中心、河北出入境检验检疫局技术中心）的相关负责人和行业专家，召开了验证研讨会，介绍了检测方法建立过程、详细阐

13、述了该方法的使用范围、原理、试剂材料、仪器设备、测定步骤等内容，并当场交接了验证技术资料、验证用标准品和样品。三家验证单位按照签订的验证协议书要求，于8月底陆续将验证材料报送，将多家实验室方法验证材料进行总结和分析；5、审定会。2010年9月向国家食药监局上报全部项目材料，召开项目审定会，论证该方法的技术指标和文本材料等；6、修改报批。根据审定会专家意见，对材料进一步补测完善，形成最终报批稿材料上报国家食药监局。五、重点说明的问题（一）关于体例。本检测方法的体例主要参照现行2007版化妆品卫生规范的卫生化学检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。（二）关于7种染发剂。见

14、附页。（三）关于检测方法的建立和验证。经过对化妆品中7种染发剂样品前处理方法的选择，分析条件的优化，最终建立了化妆品中7种染发剂的液相色谱检测方法。图1 在616nm下测得碱性蓝26标准高效液相色谱图图2 在520nm下测得碱性红51、碱性紫14、酸性紫43标准高效液相色谱图图3 在480nm下测得碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3标准高效液相色谱图表1 7种染发剂的出峰时间表染发剂名称碱性红51碱性紫14酸性紫43碱性橙31碱性黄87碱性橙3碱性蓝26出峰时间（min）22.38325.65430.26913.18622.10129.43730.389 方法验证表明，本方法中各种染发剂在一定线

15、性范围内均有较好的线性相关系数（0.999），具体见表2， 7种染发剂的方法检出限见表3，在5.0mg/kg，50.0mg/kg两个添加水平时，提取回收率在85.5104.3%之间，方法回收在84.299.5%之间。日内精密度在0.834.33%之间（n=6），日间精密度在1.785.39%之间（n=3）；日内（24h）和日间（5天）稳定性符合要求。上述结果证实，本方法可以满足化妆品中7种染发剂的检测要求，并最终确定采用外标法计算样本中7种染发剂的含量。三家实验室验证结果表明，回收率、精密度、标准曲线均符合要求，证实所建立方法可作为化妆品中7种染发剂的检测方法.表2 标准溶液标准曲线和线性范围

16、目标物质线性范围线性方程线性相关系数碱性蓝265100 mg/LY=26000X-3500R=0.9998酸性橙35100 mg/LY=1240X+304R=0.9989碱性黄875100 mg/LY=1030X+208R=0.9982碱性橙315100 mg/LY=18400X-1920R=0.9998酸性紫43550 mg/LY=2890X-938R=0.9998碱性紫14550 mg/LY=23900X-14500R=0.9999碱性红515100 mg/LY=21000X-7080R=0.9999表3 7种染发剂的检出限和定量限染发剂名称碱性红51碱性紫14酸性紫43碱性橙31碱性黄8

17、7酸性橙3碱性蓝26检出限（mg/kg）0.060.060.61.23.01.20.6定量限（mg/kg）0.20.22.03.5103.52.0六、专家意见与反馈（会议时间：2012年9月）根据国家食品药品监督管理局保化司（以下称保化司）有关化妆品中禁限用物质检测方法委托工作的要求，河北省保健食品化妆品协会组织完成了化妆品中马来酸二乙酯、环氧乙烷、环氧丙烷、17种着色剂的检测方法研究。并于2012年9月20日，就上述检测方法，组织召开专家论证会。与会专家认真听取了项目承担单位关于检测方法、编制说明、验证报告的汇报，审阅了检测方法，并进行了讨论，一致认为：一、河北省保健食品化妆品协会建立的化妆

18、品中马来酸二乙酯、环氧乙烷、环氧丙烷、17种着色剂的检测方法，基本满足现阶段化妆品中上述禁限用物质的检测要求。二、检测方法的书写较规范、内容较全面。与会专家对上述检测方法分别提出了具体修改建议。建议项目承担单位按照本次会议意见，对化妆品中马来酸二乙酯、环氧乙烷、环氧丙烷、17种着色剂的检测方法，进行修改完善后报国家食品药品监督管理局保化司。七、国家食药监局保化司组织专家论证会（2012年11月16日）专家建议进一步补充完善后，提交国家食药监局保化司。化妆品中7种染发剂的检测方法编制说明第一部分 基本信息1 简介染发剂由于其功能性的作用，被广泛的应用于化妆品尤其是染发剂和烫发剂。化妆品中使用的染

19、发剂多数是化学合成，长期或过量使用都会对人体健康产生潜在的危害，有的染发剂会引起人的过敏反应，有的染发剂会引起皮肤发炎，还有的会透过皮肤被人体吸收，有明显的致突变作用，长期使用此类产品甚至可以诱发癌症。为了安全起见，世界上很多国家对化妆品用染发剂做了法律性规定。我国化妆品卫生规范中对化妆品用染发剂品种、使用范围和限制条件也都作了明确的规定。目前对化妆品中常用染发剂的检测尚未形成完整和成熟的方法，非常不利于对化妆品市场的监管和管理。本项旨在借助高效液相色谱法，建立化妆品中可能添加的染发剂类物质的检测方法。同时为了保障化妆品质量安全，也为了化妆品中禁用物质行政监管和企业自检控制提供技术依据，特制定

20、该批标准。2 属性信息2.1碱性橙312.1.1中文名：碱性橙312.1.2 英文名称：BASIC ORANGE 312.1.3 INCI名称：BASIC ORANGE 312.1.4 分子式：C11H14ClN52.1.5 分子量：251.715362.1.6 CAS号：97404-02-9 2.1.7 结构式：2.1.8 限定标准化妆品卫生规范2007年版规定化妆品染发剂中最大允许使用浓度0.2%。当与氧化乳混合使用时, 最大使用浓度应为0.1%。2.2碱性黄872.2.1中文名：碱性黄872.2.2 英文名称：Basic Yellow 872.2.3 INCI名称：Basic yello

21、w 872.2.4 分子式：C15H19N3O4S2.2.5 分子量：337.394062.2.6 CAS号：116844-55-42.2.7 结构式：2.2.8 限定标准化妆品卫生规范2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：0.2%。当与氧化乳混合使用时, 最大使用浓度应为0.1%。2.3碱性红512.3.1中文名：碱性红512.3.2 英文名称：BASIC RED 51;2.3.3 INCI名称：Basic red 512.3.4 分子式：C14H18CIN52.3.5 分子量：279.772.3.6 CAS号：12270-25-62.3.7 结构式：2.3.8 限定标准化妆品卫生规范2

22、007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：0.2%。当与氧化乳混合使用时, 最大使用浓度应为0.1%。2.4碱性紫142.4.1中文名：碱性紫14，碱性品红2.4.2 英文名称：FUCHSIN BASIC2.4.3 INCI名称：Basic Violet 142.4.4 分子式：C20H20ClN32.4.5 分子量：337.852.4.6 CAS号：632-99-52.4.7 CI号：CI425102.4.8 结构式：2.4.9 限定标准化妆品卫生规范2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：0.3%。当与氧化乳混合使用时, 最大使用浓度应为0.15%。2.4.10 理化特性黄绿色闪光结晶块状

23、或砂状物。溶于冷、热水中呈红紫色，极易溶于酒精中呈红色。遇浓硫酸呈黄棕色，稀释后几乎无色。其水溶液加氢氧化钠液呈带有红色沉淀的几乎无色液体。2.5酸性紫432.5.1中文名：酸性紫432.5.2 英文名称：JAROCOL VIOLET 432.5.3 INCI名称：Acid Violet 432.5.4 分子式：C21H14NNaO6S2.5.5 分子量：431.392.5.6 CAS号：224-618-72.5.7 CI号：CI607302.5.8 结构式：2.5.9 限定标准化妆品卫生规范2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：1.0%。当所用染发剂纯度不得80%, 其杂质含量必须符合以

24、下要求: 挥发性成分(135)及氯化物和硫酸盐(以钠盐计)小于18%, 水不溶物不得小于0.4%, 1-羟基-9,10- 蒽二酮(1-hydroxy-9,10-anthracenedione) 小于0.2%, p-甲苯胺(p-toluidine)小于0.1%, p-甲苯胺磺酸钠(p-tolluidine sulfonic acids, sodium salts)小于0.2%,其它染发剂(subsidiary colors) 小于1%, 铅小于20mg/kg, 砷小于3mg/kg, 汞小于1mg/kg。2.5.10 理化特性溶于乙醇。于浓硫酸中呈蓝色，稀释后呈橄榄棕色，并伴有紫色沉淀产生。2.6

25、酸性橙32.6.1中文名：酸性橙 32.6.2 英文名称：ACID ORANGE 32.6.3 INCI名称：Acid Orange 32.6.4 分子式：C18H13N4NaO7S2.6.5 分子量：452.373192.6.6 CAS号：228-921-52.6.7 结构式：2.6.8 限定标准化妆品卫生规范2007年版规定在化妆品中最大允许使用量：0.2%。2.6.9 理化特性橙黄色粉末。极易溶于冷水和热水中，在水中溶解度为 50g/L (90)，水溶液呈黄色。易溶于乙醇，呈橙棕色。于浓硫酸中呈黄色，稀释后转呈暗黄色，有沉淀产生。2.7 碱性蓝262.7.1中文名：碱性蓝262.7.2

26、英文名称：Basic Blue 262.7.3 INCI名称：Basic Blue 262.7.4 分子式：C33H32ClN32.7.5 分子量：506.092.7.6 CAS号：2580-56-5 2.7.7 CI号：CI440452.7.8 结构式：2.7.9 限定标准化妆品卫生规范2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：0.5%。当与氧化乳混合使用时, 最大使用浓度应为0.25%。2.7.10 理化特性深紫色 (或灰绿色闪光) 粉末。溶于冷水、热水均呈蓝色。溶于乙醇呈蓝色。于浓硫酸中呈红光棕色，稀释后由黄变绿再变为蓝色。于浓硝酸中呈橄榄绿色。其水溶液加入氢氧化钠产生暗红棕色沉淀；加入

27、盐酸产生蓝色沉淀。第二部分 方法选择与优化1 分析方法及其条件的选择与优化1.1 分析方法的选择根据文献报道化妆品中染发剂适用于高效液相色谱分离与检测。2007版化妆品卫生规范中只是规定了“化妆品组分中暂时允许使用的染发剂”的种类，并未对其方法进行限定。目前国内外的检测方法有高效液相色谱-紫外可见检测法、高效液相色谱-串联质谱法及高效液相色谱-二极管阵列检测法等，本方法参考文献中有关染发剂含量的检测方法，确定了采用高效液相色谱-二极管阵列检测法。1.2 前处理优化实验1.2.2 提取溶剂选择对于样品采用超声方式对样品进行提取，分别考察了乙醇、甲醇、乙腈、异丙醇-水（1:1）以及四氢呋喃-水（1

28、:1）等多种提取溶剂对含有染发剂的加标样品测定结果的影响。结果表明, 甲醇和四氢呋喃-水(体积比为1：1)体系的提取效率相当。考虑到四氢呋喃毒性较大, 最终选择甲醇为最佳提取溶剂。表 1 试样提取回收率实验结果汇总表提取溶剂添加浓度/mg/kg回收率范围/%RSD范围/%乙醇20.082.993.80.682.47甲醇20.092.199.21.523.81乙腈20.078.994.22.345.41异丙醇-水（1:1）20.074.889.83.684.47四氢呋喃-水（1:1）20.091.3102.22.533.3951.2.1 超声时间的优化选择不同的提取时间（5，10，15，20，3

29、0，45，60 min）进行实验。结果表明，30min就可将样品中的染发剂类化合物提取完全，见图1。图1 不同提取时间的影响1.3.1 四氢呋喃的加入量考虑到色淀的提取复杂性，加入一定量的四氢呋喃，促进提取的回收率。四氢呋喃加入量分别为0.5、1.0、1.5、2.0，以碱性黄色淀为目标物，加入1.0ml四氢呋喃时，使用本方法测定其含量达到标称含量。1.2 定量方法的建立1.2.1 液相色谱条件的建立甲醇是液相色谱常用的溶剂。我们通过对不同浓度的甲醇，0.02mol/L乙酸胺溶液进行对比实验，最终确定实验方案，结果表明甲醇（A）+ 0.02mol/L乙酸铵（B）梯度洗脱（见表1）时可以较好的分离

30、目标物。通常为保护色谱柱填料，选用流速为1.0mL/min。由于在该条件下，随柱温升高，会影响定性和定量准确度，故选用常温（25）作为色谱温度较为合适。表2 梯度洗脱程序时间，min流动相A（%）流动相B（%）05951030702580203580201.2.2 色谱柱的选择实验比较了C18柱、C8柱和苯基柱对7种染发剂的分离效果及峰形，结果表明使用C18目标峰形尖锐，而且目标物与杂质能够完全分离，排除了基质的干扰。1.2.3 柱温的选择实验比较了柱温在20、30、40、50下对目标物保留时间和色谱峰形的影响，结果表明在不同柱温下色谱峰形及保留时间无明显变化，因此选择常温的30为分析温度。1.2.4检测波长的确定1.2.4.1 紫外检测器波长在616nm下测得碱性蓝26；在520nm下测得碱性红51、碱性紫14、酸性紫43；在480nm下测得碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3。1.2.4.2 最大吸收波长