Vaspin在骨性关节炎中的作用及其机制研究外科学专业毕业论文.docx

1、Vaspin在骨性关节炎中的作用及其机制研究外科学专业毕业论文Vaspin在骨性关节炎中的作用及其机制研究-外科学专业毕业论文万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据万方数据浙江大学博士学位论

2、文 3 Vaspin对培养软骨细胞具有抗炎抗降解作用一一暑奄H)N潼ouW掩掩辑您博g辱42OIL-tI 一 。 + v8pin缒嘲一l口始100渤剃lo so m 220湖篇 。誉毒lo薹v；o系辩髓瓣狰。毪l彝 一 一 一 一 一 一 + + + + + a-113 一 _ + + +嘲褥嗍-lo 辩l2辩蝴 瓣 蜘l250鲋v嬲曲秘霉螂一10 鲐100 250 粥 10 _tO l瑚蝴图39不同浓度vaspin对大鼠关节软骨细胞培养上清液中COX-2，PGE2和iNOS 含量的影响。经不同浓度的vaspin干预后加入IL1B(10ngm1)，孵育24小时。 士Po05，士去Po01(与几

3、一lB刺激组相比)34讨论炎症反应和降解酶类因子对关节软骨的破坏是OA病程的主要事件。其中 MMPs和ADAMTS是最重要的蛋白水解酶。研究发现在病变的软骨、半月板和滑 膜组织中高表达的MMP一2和MMP9在OA病变过程中起到了重要作用【14】。MMP2 和MMP9又分别被称为明胶酶A和明胶酶B，能够降解诸多软骨蛋白结构包括Iv 型、V型VII、和x型胶原，以及关节软骨特殊的xI型胶原，聚糖核心蛋白和典 型的II型胶原蛋白13,48】。而ADAMTS家族中最重要的ADAMTS4和ADAMTS一5 也积极参与了OA进程，它们被认为是最起效的蛋白聚糖酶，两者又分别被称为万方数据浙江大学博士学位论文

4、 3 vaspiII对培养软骨细胞具有抗炎抗降解作用蛋白聚糖酶1和蛋白聚糖酶2【16】：ADAMTS4和ADAMTS5都具有强大的蛋白多 糖降解能力H9511，在正常和OA人群的软骨中都有两者的表达，且OA患者软骨组 织中含量明显增加，与软骨破坏程度相关【521。有研究者在动物模型中将两者的基 因敲除，发现可以有效的阻止蛋白聚糖的水解，减轻关节炎的病变-54。炎症反应是引起关节炎组织肿胀破坏，主观感受疼痛的重要原因。其中IL1p 被公认为最重要最经典的炎症因子，而且以IL一1D作为诱导软骨细胞炎症反应的体 外模型已被广泛使用【551。IL1p能够诱导软骨细胞产生COX一2和iNOS等一系列炎

5、症因子，而后两者被认为积极参与了OA病程的发展10】。COX2和iNOS可以诱 导软骨细胞产生PGE2和NO，而后两者又可增加IVIIPs的表达，并且是关节疼痛 的主要因子II,121。PGE2在OA病变过程中亦可直接破坏关节软骨5657】。在本实验中，我们首次观察了vaspin对体外培养的关节软骨细胞的作用。首 先我们呆用CCK-8法检测vaspin对软骨细胞活力的影响。结果显示，培养液中 vaspin浓度达到500ngml及其以下时不会对软骨细胞的活力造成影响，该结果说 明vaspin对软骨细胞具有较高的安全性。另外，我们用10ngml的IL一1B刺激软骨 细胞，以不同浓度的vaspin干

6、预，以降解酶类因子MMP2，MMP一9，ADAMTS4， ADAMTS5和炎症因子COX2，PGE2和iNOS作为观测指标，通过实时定量PCR分析我们发现，IL1 B诱导了上述降解酶类因子的基因表达(Po05)，而低浓度 的vaspin(10ngm和50ngm1)干预可拮抗IL一1p介导的MMP一2，MMP一9，和 ADAMTS一5的表达。当我们用ELISA方法检测软骨细胞上清液中炎症因子含量的 变化时，结果显示：IL1B显著增加了细胞上清液中COX2，PGE2和iNOS含量 (Po05)，而采用不同浓度的vaspin干预可拮抗IL1p的炎症效应，且浓度达 100ngml时抑制效果达显著差异(

7、P005)。我们的结果提示，vaspin具有拮抗IL1p诱导的关节软骨细胞炎症和降解反应。 以往的一些研究表明，区别于脂肪因子家族其他成员的作用，vaspin对某些细胞具 有抗炎抗凋亡的作用27,31,58。Vaspin在血管平滑肌细胞中表现出来拮抗TNF。旺介万方数据浙江大学博士学位论文 3、协pin对培养软骨细胞具有抗炎抗降解作用导的炎症反应【271，而在慢性肝炎模型中，vaspm具有抑制炎症因子TNF仪和同家 族促炎因子leptin和resisfin的作用【321。然而，vaspin在软骨细胞中的作用此前并 无相关研究报道，我们本部分的研究结果首次揭示了vaspin对软骨细胞具有抗炎 抗

8、降解作用。在此部分实验中，我们发现vaspin对体外培养的软骨细胞具有抗炎抗降解作 用，但是其发挥作用的浓度并不一致。在较低的浓度(10-50ngml范围)，vaspin显 著抑制了IL一1B介导的降解酶类因子MMP一2，MMP9和ADAMTS一5的基因表达， 而当浓度达到了100ngml以上直到500ngml，这种作用并不显著，况且对于另外 一个重要的降解酶因子ADAMTS一4来说，各个浓度均未达到显著抑制作用。Vaspin 低浓度具有抗降解作用，而高浓度却无法抑制IL1B介导的降解作用，是否意味着 vaspin在软骨细胞中具有双向作用，具体的作用机制是值得我们进一步深入研究 的。另外，va

9、spin对抗ILlp介导的炎症反应呈现出浓度依赖性，较高浓度的vaspin (100ngml以上)显著抑制了ILlp介导的COX2，PGE2和iNOS含量升高，这 个结果明确提示了vaspin对软骨细胞具有的抗炎作用。然而，相关的抗炎分子机 制并不明确，需要进一步研究。35小结1)浓度达500ngml的vaspin对关节软骨细胞活性无影响。 2)Vaspin可拮抗IL一1p介导的关节软骨细胞降解因子MMP2，MMP一9和ADAMTS5的基因表达，以及炎症因子COX一2，PGE2和iNOS表达。40万方数据浙江大学博士学位论文4 Vaspin拮抗IL-I B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研

10、究4 Vaspin拮抗IL一1ljI介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究41 引言OA以关节软骨进行性退变为特点，炎症因子和降解因子都发挥了重要作用， 其中的分子机制是非常复杂的，多种信号通路包括晚期糖基化终末产物受体信号 通路(Advanced glycationend productsreceptor,AGEsRAGE)59,60，丝裂原活化蛋 白酶(Mitogenactivated protein kinase，MAPK)【61】，Wnt13一连环蛋白621和核转录因 子kappaB(NuclearfactorkappaB，NFrd3)信号通路参与了OA病程的发展。其中NFrA3信号

11、通路在OA发病中的作用受到了研究者的重视。IL1p可激活NFrd3信 号通路，而NFvd3信号通路的激活可以诱发下游诸多炎症因子和降解酶因子的转 录，从而降解破坏关节软骨【631。针对NFrd3信号通路的研究用于治疗OA已被众 多研究者所意识到【201。在上一部分研究中，我们的研究结果表明，在体外培养的关节软骨细胞中， 低浓度的vaspin(10-50ngm1)具有拮抗IL一1p介导的细胞降解因子MMP一2，MMP一9 和ADAMTS5的基因表达，而高浓度的(100ngml以上)vaspin具有抑制ILlp 介导的细胞上清液中炎症因子COX一2，PGE2和iNOS的表达。然而，vaspin对I

12、L一1p 拮抗作用和上述因子的抑制作用分子机制尚不明确。因此，在本部分研究中，我 们研究了vaspin拮抗IL1p的具体分子机制。有研究表明，vaspin能够通过抑制信号通路NF1(B的活化从而抑制TNF一伐介 导的血管平滑肌细胞凋亡和炎症反应271，在体外培养的血管平滑肌细胞中，随着 vaspin浓度的升高，显著抑制了NFrd3的磷酸化和Ird3一cc的降解【271。此外，不同 的学者还发现在体外培养的内皮细胞中，vaspin能够通过抑制NFrd3信号通路的 激活，起到抗炎作用64,65。这些研究结果均表明，在不同的细胞中，vaspin可以通 过抑制NFrB信号通路达到抑制炎症的目的。因此，

13、我们猜测vaspin在软骨细胞万方数据浙江大学博士学位论文 4 Vaspin拮抗IL1 13介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究中的抗炎作用，是否也与抑制NF一1(B信号通路有关。 本部分研究采用上一部分实验中建立的大鼠关节软骨细胞培养方案，用Western blot方法检测了vaspin对IL1p刺激后关节软骨细胞中NFrB信号通路的影响。用ELISA法检测NFrB信号通路抑制剂(BAY 117082)对软骨细胞上清 液中COX2，PGE2和iNOS的含量变化。42材料与方法421主要实验仪器台式离心机 德国Heraeus公司低温高速离心机 德国Heraeus公司4摄氏度冰箱 德国Sie

14、mens公司-80摄氏度冰箱 日本Sanyo公司无菌操作台 美国Thernlo公司细胞培养箱 日本Sanyo公司称量天平 美国Ohaus公司移液器 德国Eppendorf公司光学显微镜 日本OLYMPUS公司雪花状制冰机 美国Ross Temp公司高压蒸汽灭菌器 日本Sanyo公司离心管 美国Coming公司细胞培养板 美国Coming公司细胞计数板 上海精密仪器仪表有限公司一次性过滤器 上海半岛实业有限公司42万方数据浙江大学博士学位论文4 Vaspin拮抗IL-1 B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究紫外分光光度仪 美国Hewlett Packard公司恒温水浴箱 上海医用恒温设备厂

15、水平摇床 江苏太仓市科教器材厂25cm2细胞培养瓶 美国Coming公司6cm2细胞培养皿 美国Coming公司422实验试剂人重组vaspin 美国PeproTech公司人重组ILlp 美国Sigma公司4周龄SD大鼠 浙江大学动物中心高糖DMEM培养基 美国Gibco公司青一链霉素 美国Gibco公司PBS 美国Gibco公司02链酶蛋白酶 美国Sigma公司01胶原酶 美国Sigma公司胎牛血清 美国Gibco公司o25胰蛋白酶(含002EDTA) 美国Gibco公司二甲基亚砜(DMSO) 美国Sigma公司去离子水 美国Sigma公司细胞浆、核蛋白提取试剂盒 江苏碧云天生物公司过硫酸铵

16、 美国Promega公司四甲基乙二胺(TEMED) 美国BioRad公司BCA蛋白质分析测定试剂 美国Pierce公司丙烯酰胺 美国AMRESCO公司N，N亚甲双丙烯酰胺 美国AMRESCO公司十二烷基硫酸钠(SDS) 美国AMRESCO公司43万方数据浙江大学博士学位论文 4 Vasp_in拮抗IL-1 B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制!壅 Tris(Z羟甲基氨基甲烷) 美国AMRESCO公司5蛋白质上样缓冲液 美国Pierce公司二硫苏糖醇(DTT) 美国Invirtrogen公司BAY 1l一7082 美国Calbiochem公司423实验试剂的配制4231 30丙烯酰胺29丙烯酰

17、胺1N，N亚甲双丙烯酰胺 用ddH20溶解后室温保存。 4232 15MIrisHCI(pH88)Tris碱19159 蒸馏水40ml溶解后用浓盐酸调pH至88，加水至100ml，4摄氏度保存。4233 1 M Tris-HCl(pH68)Tris碱1319 蒸馏水40ml溶解后浓盐酸调pH至68，加蒸馏水至100ml，4摄氏度保存。4234 1M DTT DTT 3099001M的乙酸钠溶液20ml(pH52)万方数据浙江大学博士学位论文 4 vaspm拮抗IL-l 8介导的软骨细胞炎症降解作用的分子垫趔翌究溶解后分装，20摄氏度保存。4 2 3 5 10SDS109SDS溶于ddH20后定

18、容至100ml。4236 10过硫酸铵 o19过硫酸铵溶于lmlddH20，一20摄氏度保存，每周配制。4237 8分离胶(Sml)ddH20 23ml30丙烯酰胺 13ml15MTris(pH 88) 13ml10SDS 005ml10过硫酸铵 005mlTEMED 0003ml4238 5积层胶(2m1)ddH20 4ml30丙烯酰胺 033ml1Mtris(pH68) 025ml10SDS 002ml10过硫酸铵 0。02mlTEMED 0002ml4239 5xTris一甘氨酸电泳缓冲液45万方数据浙江大学博士学位论文4 Vaspin拮抗lL-I B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制

19、研究Tris碱 1519甘氨酸 949SDS 59ddH20 800ml临用前以ddH20稀释至1浓度的电泳缓冲液。42310 5xTBSTris碱 1219NaCl 4099ddH20 800mI用HCl调pH值至74后定容至1000ml。42-311 ITBST5xTBS用ddH20稀释至1，加入o1的Tween 20，搅拌均匀。42312 5x转膜缓冲液Tris碱 1519甘氨酸 729SDS 59ddH20 800ml定容至1000mi，临用前稀释至l，并加1 5甲醇，现配现用。42313封闭液脱脂奶粉 5946万方数据浙江大学博士学位论文 4 Vaspin拮抗ml 13介导的软骨细胞

20、炎症降解作用的分子机制研究TBST 100ml4摄氏度保存42314 5x上样缓冲液10 M Tris(pH68) 06ml50甘油 5ml10SDS 2mlp巯基乙醇 05ml1溴酚蓝 lmlddH20 09ml424实验方法和步骤4241大鼠关节软骨细胞培养 见上一部分实验的细胞培养部分。4242大鼠关节软骨细胞处理大鼠关节软骨细胞按1x106皿接种于6 cm2细胞培养皿中。待细胞长满板底 约80左右时，换无血清培养基过夜进行同步化处理。其后大鼠关节软骨细胞用0、 10、50,100、250和500ngml浓度的vaspin预处理24小时，然后加入IL1p(最终浓度10ngm1)，继续孵育

21、1小时，收集软骨细胞进行Western blot检测。另外，将软骨细胞按20x104孔接种于24孔细胞培养板中。待细胞长满板底 约80左右时，换无血清培养基过夜进行同步化处理。其后软骨细胞用NFr,B抑 制剂(BAY 11-7082，1州)预处理1小时，然后加入IL-11(最终浓度10ngm1)，继续孵育24小时。最后收集细胞上清，进行ELISA检测。47万方数据浙江大学博士学位论文4 Vaspin拮抗IL1 13介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究 4243 Western blot检测42431蛋白的提取 吸去培养基，用冷PBS洗涤2次，每次3分钟，然后每个培养皿中加入lml预冷的PB

22、S，用刮除法在冰上收集软骨细胞，收集后再用预冷的PBS洗涤2次，弃上清。然后使用蛋白提取试剂盒，根据说明书逐步操作，提取胞浆蛋白。 42432蛋白浓度测定蛋白定量采用Bradford测定法，用BSA(0，02，05，075，10，15，30，50， 75，10099m1)绘制标准曲线，取5山样品，用ddH20稀释到259l，其后加入2009l 工作液，在570nm下测定吸光度，根据标准曲线计算相应的结果，蛋白浓度为测定结果的5倍。 42433丙烯酰胺凝胶电SDSPAGE取相当于5099蛋白的样品，加入等量的5x SDS上样缓冲液，100摄氏度煮 沸5分钟，冷却后放于冰上备用。 先配制8分离胶，

23、用水封闭，室温放置30分 钟后分离胶凝固，其后灌注5积层胶，插入Teflon梳子，室温放置30分钟，待 积层胶凝固后取出梳子，清洗加样孔，放入电泳槽中，加入Tris。甘氨酸缓冲液， 在上样孔中加入样品及Marker，接通电源，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至适当位置。42434转膜裁取适-3大小的PVDF膜和4张3M滤纸，PVDF膜依次浸泡于无水甲醇及转 膜液中，滤纸浸于转膜液中，平衡20分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张 3M滤纸及1块海绵，然后置入转膜槽中，于250mA恒流转膜，时间根据目的蛋 白大小调节。42435封闭万方数据浙江大学博士学位论文4 Vaspin拮抗IL-

24、1 0介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究将转有蛋白的膜浸于含5脱脂奶粉的TBST中封闭液中封闭1小时。 42436杂交取出封闭好的膜，孵育一抗，垂直混悬仪4摄氏度过夜，BST漂洗lo分钟3 次，孵育二抗，室温缓摇l小时，TBST漂洗10分钟3次。42437压片、洗片取出膜，配制显色液(ECL A液07mI+ECL B液07m1)，加在膜上，5分钟后 吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒中。压片后分别过显影液(30秒)、清水、 定影液(30秒)洗片显影。42438数据分析采用Bandscan 50软件分析条带的光密度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白 (光密度值)内参13-actin(光密度

25、值)进行表示，结果以平均数土标准差表示。 4244 ELISA检测方法见上一部分实验的ELISA方法。 425统计学分析实验结果用SPSS 160统计软件分析处理，结果以均数4-标准差表示，所有均 数土标准差均来自3次独立实验的结果，均数差异性比较采用t检验。以Po05 表示有显著性统计学意义。43结果431 Vaspin抑制IL一1p介导的NFrB磷酸化和IKB一位的降解 此前的研究部分我们低浓度的vaspin能够抑制ILlp介导的体外培养关节软骨细胞中降解因子的基因表达，而高浓度的vaspin能够抑制细胞上清液的COX一2，PGE2和iNOS的含量。这种抑制作用的机制尚不明确，为此，我们初

26、步探索了vaspin 对上述炎症降解因子作用可能涉及的信号通路。本部分实验中，我们直接观察了49万方数据浙江大学博士学位论文4 Vaspin拮抗IL-1 B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究不同浓度vaspin对NFrB信号通路的影响。结果发现，IL-113作用大鼠关节软骨细 胞后，可引起NFrB磷酸化含量增加，而IrBCt的分解增加。但是加入不同浓度 (10500ngm1)的vaspin之后，随着浓度的增加，即可抑制抑制IL一1D介导的NFrB 磷酸化和Ir,Bq的降解，当浓度达100ngml时，NFrB的磷酸化被显著抑制，而当 浓度达50ngml时，Ir,BO【的分解抑制达到显著差异

27、水平(P005)(图41)。A i黪灏辆麟霸垂滚斓蘩鳓蝴醪囊黼瓣。鳓黪p-NF-rB钢懒睡囊黪攀黉鳜灞獭黪舞懒嘲猁嘲黪黪Ird3。理1：濑溺翻灏晒警溯一翻骥醚辆i 13-actinm18 。 + + + + + +Vaspin(ngm1)- - lo 50 100 250 500DD O 140O 12010080O蚤OlI召譬矗】D。mpI 60O H暑。碍。)l。臣乙。 40O鲫：霁狮撼5 O 20O O一 + + + + + + 一 + + + + + IL-113Vaspia(ngmb一 一 lO 50 100 250 500 一 一 10 50 100 250 500图41 Vasp

28、in抑制IL一1p介导的NFgB磷酸化和IKB一仪的降解，经不同浓度的 vaspin干预后加入IL一1p(10ngm1)。孵育24小时。士P005(与IL一1p刺激组 相比)432信号通路抑制剂BAYll一7082对细胞上清液COX一2，PGE2和iNOS含量的影响50万方数据浙江大学博士学位论文4 vaspin拮抗IL-I B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究为进一步验证NFr：B信号通路在软骨细胞炎症因子表达中的作用，我们用 NFvd3抑制剂BAYll-7082干预软骨细胞，用ELISA方法检测细胞上清液中COX2， PGE2和iNOS含量的变化。ELISA结果表明，加入NFvB抑制剂后，细胞上清中 COX一2，PGE2和iNOS的含量与IL一1p组相比有均有明显下降，达到显著差异水 平(P005)。 (图42，图43，图44)。) 毒 詈 胃 受o oILI 13(10ngm1) 一 + +BAYl 1-7082 一 一 +图42信号通路抑制剂BAYll一7082对细胞上清液中COX2的影响。士p005 (与一1p刺激组相