我们的结果提示，vaspin具有拮抗IL．1p诱导的关节软骨细胞炎症和降解反应。
以往的一些研究表明，区别于脂肪因子家族其他成员的作用，vaspin对某些细胞具有抗炎抗凋亡的作用[27,31,58]。
Vaspin在血管平滑肌细胞中表现出来拮抗TNF。
旺介
万方数据
浙江大学博士学位论文3、协pin对培养软骨细胞具有抗炎抗降解作用
导的炎症反应【271，而在慢性肝炎模型中，vaspm具有抑制炎症因子TNF．仪和同家族促炎因子leptin和resisfin的作用【321。
然而，vaspin在软骨细胞中的作用此前并无相关研究报道，我们本部分的研究结果首次揭示了vaspin对软骨细胞具有抗炎抗降解作用。
在此部分实验中，我们发现vaspin对体外培养的软骨细胞具有抗炎抗降解作用，但是其发挥作用的浓度并不一致。
在较低的浓度（10-50ng／ml范围），vaspin显著抑制了IL一1B介导的降解酶类因子MMP一2，MMP．9和ADAMTS一5的基因表达，而当浓度达到了100ng／ml以上直到500ng／ml，这种作用并不显著，况且对于另外一个重要的降解酶因子ADAMTS一4来说，各个浓度均未达到显著抑制作用。
Vaspin低浓度具有抗降解作用，而高浓度却无法抑制IL．1B介导的降解作用，是否意味着vaspin在软骨细胞中具有双向作用，具体的作用机制是值得我们进一步深入研究的。
另外，vaspin对抗IL—lp介导的炎症反应呈现出浓度依赖性，较高浓度的vaspin（100ng／ml以上）显著抑制了IL—lp介导的COX．2，PGE2和iNOS含量升高，这个结果明确提示了vaspin对软骨细胞具有的抗炎作用。
然而，相关的抗炎分子机制并不明确，需要进一步研究。
3．5小结
1）浓度达500ng／ml的vaspin对关节软骨细胞活性无影响。
2）Vaspin可拮抗IL一1p介导的关节软骨细胞降解因子MMP．2，MMP一9和
ADAMTS．5的基因表达，以及炎症因子COX一2，PGE2和iNOS表达。
40
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-IB介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
4Vaspin拮抗IL一1ljI介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研
究
4．1引言
OA以关节软骨进行性退变为特点，炎症因子和降解因子都发挥了重要作用，其中的分子机制是非常复杂的，多种信号通路包括晚期糖基化终末产物／受体信号通路（Advancedglycationendproducts／receptor,AGEs／RAGE）[59,60]，丝裂原活化蛋白酶（Mitogen．activatedproteinkinase，MAPK）【61】，Wnt／13一连环蛋白‘621和核转录因子kappaB（NuclearfactorkappaB，NFrd3）信号通路参与了OA病程的发展。
其中
NFrA3信号通路在OA发病中的作用受到了研究者的重视。
IL．1p可激活NFrd3信号通路，而NFvd3信号通路的激活可以诱发下游诸多炎症因子和降解酶因子的转录，从而降解破坏关节软骨【631。
针对NFrd3信号通路的研究用于治疗OA已被众多研究者所意识到【201。
在上一部分研究中，我们的研究结果表明，在体外培养的关节软骨细胞中，低浓度的vaspin（10-50ng／m1）具有拮抗IL一1p介导的细胞降解因子MMP一2，MMP一9和ADAMTS．5的基因表达，而高浓度的（100ng／ml以上）vaspin具有抑制IL—lp介导的细胞上清液中炎症因子COX一2，PGE2和iNOS的表达。
然而，vaspin对IL一1p拮抗作用和上述因子的抑制作用分子机制尚不明确。
因此，在本部分研究中，我们研究了vaspin拮抗IL．1p的具体分子机制。
有研究表明，vaspin能够通过抑制信号通路NF．1（B的活化从而抑制TNF一伐介导的血管平滑肌细胞凋亡和炎症反应‘271，在体外培养的血管平滑肌细胞中，随着vaspin浓度的升高，显著抑制了NF—rd3的磷酸化和Ird3一cc的降解【271。
此外，不同的学者还发现在体外培养的内皮细胞中，vaspin能够通过抑制NF．rd3信号通路的激活，起到抗炎作用[64,65]。
这些研究结果均表明，在不同的细胞中，vaspin可以通过抑制NF．r．B信号通路达到抑制炎症的目的。
因此，我们猜测vaspin在软骨细胞
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL．113介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
中的抗炎作用，是否也与抑制NF一1（B信号通路有关。
本部分研究采用上一部分实验中建立的大鼠关节软骨细胞培养方案，用
Westernblot方法检测了vaspin对IL．1p刺激后关节软骨细胞中NFr．B信号通路的
影响。
用ELISA法检测NF—r．B信号通路抑制剂（BAY11．7082）对软骨细胞上清液中COX．2，PGE2和iNOS的含量变化。
4．2材料与方法
4．2．1主要实验仪器
台式离心机德国Heraeus公司
低温高速离心机德国Heraeus公司
4摄氏度冰箱德国Siemens公司
-80摄氏度冰箱日本Sanyo公司
无菌操作台美国Thernlo公司
细胞培养箱日本Sanyo公司
称量天平美国Ohaus公司
移液器德国Eppendorf公司
光学显微镜日本OLYMPUS公司
雪花状制冰机美国RossTemp公司
高压蒸汽灭菌器日本Sanyo公司
离心管美国Coming公司
细胞培养板美国Coming公司
细胞计数板上海精密仪器仪表有限公司
一次性过滤器上海半岛实业有限公司
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万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-1B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
紫外分光光度仪美国HewlettPackard公司
恒温水浴箱上海医用恒温设备厂
水平摇床江苏太仓市科教器材厂
25cm2细胞培养瓶美国Coming公司
6cm2细胞培养皿美国Coming公司
4．2．2实验试剂
人重组vaspin美国PeproTech公司
人重组IL—lp美国Sigma公司
4周龄SD大鼠浙江大学动物中心
高糖DMEM培养基美国Gibco公司
青一链霉素美国Gibco公司
PBS美国Gibco公司
0．2％链酶蛋白酶美国Sigma公司
0．1％胶原酶美国Sigma公司
胎牛血清美国Gibco公司
o．25％胰蛋白酶（含0．02％EDTA）美国Gibco公司
二甲基亚砜（DMSO）美国Sigma公司
去离子水美国Sigma公司
细胞浆、核蛋白提取试剂盒江苏碧云天生物公司
过硫酸铵美国Promega公司
四甲基乙二胺（TEMED）美国BioRad公司
BCA蛋白质分析测定试剂美国Pierce公司
丙烯酰胺美国AMRESCO公司
N，N．亚甲双丙烯酰胺美国AMRESCO公司
十二烷基硫酸钠（SDS）美国AMRESCO公司
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浙江大学博士学位论文4Vasp_in拮抗IL-1B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制!
!
壅Tris（Z羟甲基氨基甲烷）美国AMRESCO公司
5×蛋白质上样缓冲液美国Pierce公司
二硫苏糖醇（DTT）美国Invirtrogen公司
BAY1l一7082美国Calbiochem公司
4．2．3实验试剂的配制
4．2．3．130％丙烯酰胺
29％丙烯酰胺
1％N，N’．亚甲双丙烯酰胺用ddH20溶解后室温保存。
4．2．3．21．5M"Iris—HCI（pH8．8）
Tris碱19．159蒸馏水40ml
溶解后用浓盐酸调pH至8．8，加水至100ml，4摄氏度保存。
4．2．3．31MTris-HCl（pH6．8）
Tris碱13．19蒸馏水40ml
溶解后浓盐酸调pH至6．8，加蒸馏水至100ml，4摄氏度保存。
4．2．3．41MDTTDTT3．099
0．01M的乙酸钠溶液20ml（pH5．2）
万方数据
浙江大学博士学位论文4vasp．m拮抗IL-l8介导的软骨细胞炎症降解作用的分子垫趔翌究
溶解后分装，．20摄氏度保存。
423510％SDS
109SDS溶于ddH20后定容至100ml。
4．2．3．610％过硫酸铵o．19过硫酸铵溶于lmlddH20，一20摄氏度保存，每周配制。
4．2．3．78％分离胶（Sml）
ddH202．3ml
30％丙烯酰胺1．3ml
1．5MTris（pH8．8）1．3ml
10％SDS0．05ml
10％过硫酸铵0．05ml
TEMED0．003ml
4．2．3．85％积层胶（2m1）
ddH204ml
30％丙烯酰胺0．33ml
1Mtris（pH6．8）0．25ml
10％SDS0．02ml
10％过硫酸铵0。
02ml
TEMED0．002ml
4．2．3．95xTris一甘氨酸电泳缓冲液
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万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗lL-IB介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
Tris碱15．19
甘氨酸949
SDS59
ddH20800ml
临用前以ddH20稀释至1×浓度的电泳缓冲液。
4．2．3．105xTBS
Tris碱12．19
NaCl40．99
ddH20800mI
用HCl调pH值至7．4后定容至1000ml。
4．2-3．11I×TBST
5xTBS用ddH20稀释至1×，加入o．1％的Tween20，搅拌均匀。
4．2．3．125x转膜缓冲液
Tris碱15．19
甘氨酸729
SDS59
ddH20800ml
定容至1000mi，临用前稀释至l×，并加15％甲醇，现配现用。
4．2．3．13封闭液
脱脂奶粉59
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万方数据
浙江大学博士学位论文．4Vaspin拮抗m—l13介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
TBST100ml
4摄氏度保存
4．2．3．145x上样缓冲液
1．0MTris（pH6．8）0．6ml
50％甘油5ml
10％SDS2ml
p．巯基乙醇0．5ml
1％溴酚蓝lml
ddH200．9ml
4．2．4实验方法和步骤
4．2．4．1大鼠关节软骨细胞培养见上一部分实验的细胞培养部分。
4．2．4．2大鼠关节软骨细胞处理
大鼠关节软骨细胞按1x106／皿接种于6cm2细胞培养皿中。
待细胞长满板底约80％左右时，换无血清培养基过夜进行同步化处理。
其后大鼠关节软骨细胞用0、10、50,100、250和500ng／ml浓度的vaspin预处理24小时，然后加入IL．1p（最
终浓度10ng／m1），继续孵育1小时，收集软骨细胞进行Westernblot检测。
另外，将软骨细胞按2．0x104／孔接种于24孔细胞培养板中。
待细胞长满板底约80％左右时，换无血清培养基过夜进行同步化处理。
其后软骨细胞用NFr,B抑制剂（BAY11-7082，1州）预处理1小时，然后加入IL-11]（最终浓度10ng／m1），
继续孵育24小时。
最后收集细胞上清，进行ELISA检测。
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万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL．113介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究4．2．4．3Westernblot检测
4．2．4．3．1蛋白的提取吸去培养基，用冷PBS洗涤2次，每次3分钟，然后每个培养皿中加入lml
预冷的PBS，用刮除法在冰上收集软骨细胞，收集后再用预冷的PBS洗涤2次，
弃上清。
然后使用蛋白提取试剂盒，根据说明书逐步操作，提取胞浆蛋白。
4．2．4．3．2蛋白浓度测定
蛋白定量采用Bradford测定法，用BSA（0，0．2，0．5，0．75，1．0，1．5，3．0，5．0，7．5，10．099／m1）绘制标准曲线，取5山样品，用ddH20稀释到259l，其后加入2009l工作液，在570nm下测定吸光度，根据标准曲线计算相应的结果，蛋白浓度为测
定结果的5倍。
4．2．4．3．3丙烯酰胺凝胶电SDS—PAGE
取相当于5099蛋白的样品，加入等量的5xSDS上样缓冲液，100摄氏度煮沸5分钟，冷却后放于冰上备用。
先配制8％分离胶，用水封闭，室温放置30分钟后分离胶凝固，其后灌注5％积层胶，插入Teflon梳子，室温放置30分钟，待积层胶凝固后取出梳子，清洗加样孔，放入电泳槽中，加入Tris。
甘氨酸缓冲液，在上样孔中加入样品及Marker，接通电源，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，
电泳至适当位置。
4．2．4．34转膜
裁取适"-3大小的PVDF膜和4张3M滤纸，PVDF膜依次浸泡于无水甲醇及转膜液中，滤纸浸于转膜液中，平衡20分钟，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸及1块海绵，然后置入转膜槽中，于250mA恒流转膜，时间根据目的蛋白大小调节。
4．2．4．3．5封闭
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-10介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
将转有蛋白的膜浸于含5％脱脂奶粉的TBST中封闭液中封闭1小时。
4．2．4．3．6杂交
取出封闭好的膜，孵育一抗，垂直混悬仪4摄氏度过夜，BST漂洗lo分钟×3次，孵育二抗，室温缓摇l小时，TBST漂洗10分钟×3次。
4．2．4．3．7压片、洗片
取出膜，配制显色液（ECLA液0．7mI+ECLB液0．7m1），加在膜上，5分钟后吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒中。
压片后分别过显影液（30秒）、清水、定影液（30秒）洗片显影。
4．2．4．3．8数据分析
采用Bandscan5．0软件分析条带的光密度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白（光密度值）／内参13-actin（光密度值）进行表示，结果以平均数土标准差表示。
4．2．4．4ELISA检测
方法见上一部分实验的ELISA方法。
4．2．5统计学分析
实验结果用SPSS16．0统计软件分析处理，结果以均数4-标准差表示，所有均数土标准差均来自3次独立实验的结果，均数差异性比较采用t检验。
以P4．3结果
4．3．1Vaspin抑制IL一1p介导的NFrB磷酸化和IKB一位的降解此前的研究部分我们低浓度的vaspin能够抑制IL—lp介导的体外培养关节软骨
细胞中降解因子的基因表达，而高浓度的vaspin能够抑制细胞上清液的COX一2，
PGE2和iNOS的含量。
这种抑制作用的机制尚不明确，为此，我们初步探索了vaspin对上述炎症降解因子作用可能涉及的信号通路。
本部分实验中，我们直接观察了
49
万方数据
浙江大学博士学位论文4Vaspin拮抗IL-1B介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
不同浓度vaspin对NFrB信号通路的影响。
结果发现，IL-113作用大鼠关节软骨细胞后，可引起NFr．B磷酸化含量增加，而IrB．Ct的分解增加。
但是加入不同浓度（10—500ng／m1）的vaspin之后，随着浓度的增加，即可抑制抑制IL一1D介导的NFrB磷酸化和Ir,B．q的降解，当浓度达100ng／ml时，NFr．B的磷酸化被显著抑制，而当浓度达50ng／ml时，Ir,B．O【的分解抑制达到显著差异水平（P<0．05）（图4．1）。
Ai黪≤灏辆麟霸垂滚斓蘩鳓蝴醪囊黼瓣。
鳓㈣黪p-NF-r．B
钢懒睡囊黪攀黉鳜灞獭黪舞懒嘲猁嘲黪黪Ird3。
理
1：
濑溺翻灏晒警◇溯一翻骥醚辆■i13-actin
m—18。
++++++
Vaspin（ng．／m1）--lo50100250500
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霁狮∞撼∞5O20
OO
一++++++一+++÷++IL-113
Vaspia（ng／mb一一lO50100250500一一1050100250500
图4．1Vaspin抑制IL一1p介导的NFgB磷酸化和IKB一仪的降解，经不同浓度的vaspin干预后加入IL一1p（10ng／m1）。
孵育24小时。
士P<0．05（与IL一1p刺激组相比）
4．3．2信号通路抑制剂BAYll一7082对细胞上清液COX一2，PGE2和iNOS含量的
影响
50
万方数据
浙江大学博士学位论文4vaspin拮抗IL-IB介导的软骨细胞炎症降解作用的分子机制研究
为进一步验证NFr：
B信号通路在软骨细胞炎症因子表达中的作用，我们用NFvd3抑制剂BAYll-7082干预软骨细胞，用ELISA方法检测细胞上清液中COX．2，PGE2和iNOS含量的变化。
ELISA结果表明，加入NFv．B抑制剂后，细胞上清中COX一2，PGE2和iNOS的含量与IL一1p组相比有均有明显下降，达到显著差异水平（P<0．05）。
（图4．2，图4．3，图4．4）。
￡）毒詈胃受
oo
ILI13（10ng／m1）一++
BAYl1-7082一一+
图4．2信号通路抑制剂BAYll一7082对细胞上清液中COX．2的影响。
士p<0．05（与Ⅱ一1p刺激组相
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