土壤解磷解钾微生物分离纯化与鉴定 级 生科4班.docx
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土壤解磷解钾微生物分离纯化与鉴定级生科4班
土壤中解磷解钾微生物的分离纯化和初步鉴定
生命科学学院
生科4班
学号
姓名
同组者
【摘要】
利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，再根据选择培养基的存活情况，确定该菌种的固氮解磷解钾属性。
根据细菌形态观察和一系列的生理生化实验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化微生物所属的类群。
【关键词】
土壤细菌解磷解钾划线分离选择培养基的配制高压蒸汽灭菌
前言：
在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。
群落是不同种类微物的混和体。
为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。
这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。
分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。
土壤微生物指的是其中的全部，不是专指在某些范围内的特殊微生物。
但是在应用时，我们更着重于对作物生长发育更有益的一些种类。
这是一个特殊的种群，它对作物来讲是影响其生长发育的重要环境条件之一。
实验目的：
1.学习利用选择培养基从土壤分离出解磷解钾的细菌以及霉菌。
2.学习运用划线分离法纯化所得的解磷解钾细菌和霉菌。
3.学习并掌握计量微生物的数目
4.根据菌落形态、染色结果、运动的结果以及生理生化实验的结果鉴定未知菌种；用小室培养法观察鉴定未知霉菌
实验原理
从混杂的微生物类群中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
通过如下几种方法可以分离纯化微生物：
稀释倒平板法（pourplatemethod）。
涂布平板法（spreadplatemethod）、稀释摇管法（dilutionshakeculturemethod）。
平板划线分离法（steadplatemethod）。
此次实验采用的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原理主要包括两个方面：
（一）选择适用于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只鲤鱼待分离微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物，
（二）微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过调取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板发或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以同显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
实验器材
1.土样：
16号土样
2.菌种：
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌
2.培养基：
钾长石固体培养基，无机磷固体培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，葡糖酵解培养基、马铃薯琼脂培养基
3.试剂：
草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、番红复染液、氢氧化钠无菌水
4.仪器：
锥形瓶（500mlx2300mlx3100mlx3）、培养皿（20套）、试管（20支）、移液枪（1支）、烧杯、玻璃棒、盖玻片、载玻片、光学显微镜、涂布棒、德汉式小管、酒精灯、漏斗、接种环、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布、称量勺、称量纸、
实验步骤
A.细菌的纯化、培养及鉴定
1.细菌的筛选
1）土样的处理
配制生理盐水：
在烧杯中配制300ml生理盐水，加入500ml的锥形瓶中，放入灭菌锅中灭菌。
加土样：
待生理盐水冷却后，准确称量10g土样，放入盛有90ml生理盐水的锥形瓶中。
将锥形瓶密封好，放入摇床中，充分震荡30min。
2）解磷解钾细菌的筛选
梯度稀释：
用移液枪吸取10ml土壤悬液加入试管中，此为10°稀释液；用移液枪吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌生理盐水的试管中充分混匀，此为10¯¹稀释液,以此类推，分别配成10¯²、
稀释液。
示意图如下：
1ml1ml1ml1ml
土壤悬液10¯¹
涂布：
配置无机磷固体培养基和钾长石固体培养基，115°灭菌20min,其中一半培养基灭菌后降温至不烫手，加入配好的链霉素1ml/L，然后倒平板，并在培养皿周边用记号笔做好标记，分别写上K、P、M（霉菌）、
、
字样，然后用移液枪分别从相应的溶液中吸取0.1ml土壤悬液放入平板中央位置，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀，其方法是将菌液先演一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90°沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次。
培养：
将平板倒置于恒温箱中培养2天。
观察并计数：
取出培养皿，观察细菌生长情况以及有无透明圈，计数，尽量选择有透明圈的菌落进行复筛。
菌落描述
2.细菌的分离纯化
1）划线分离：
再次配制无机磷固体培养基和钾长石固体培养基，灭菌后倒平板，尽量选取有透明圈的菌种，第一次划线分离培养1-2天后所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：
先在平皿上划定区域，然后将接种环在火焰上进行灭菌操作，取好友菌种的培养皿，在火焰上方（注意：
不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种环在上盖处划线以降温，然后用接种环轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。
操作完毕后对接种环进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种环冷却后从1区到2区，再如下图B所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放。
2）纯种保存：
再配制一份牛肉膏蛋白胨培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。
如图接种
3.细菌的基本形态及运动性鉴定
1）简单染色步骤
i.涂片
取一块载玻片，在上边用胶头滴管加八滴无菌水，将分别沾有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和所选6种未知菌种接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）
ii.干燥与固定
涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；
iii.染色
将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min
iv.水洗
倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；
v.干燥
用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；
vi.镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。
2）革兰氏染色步骤
i.涂片
先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。
分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。
ii.初染
滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗；
iii.媒染
先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗；
iv.脱色
先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；
v.复染
先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗；
vi.镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断未知菌种的性质。
3）半固体穿刺法观察细菌运动性
i.配制培养基
配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；
ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近（但勿触及）试管底,然后循原路退出。
如图所示：
iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。
4.细菌的生理生化实验
葡萄糖发酵试验
1）培养基配制
将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。
2）接种
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。
取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。
3）培养
将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。
5.土壤中解磷解钾细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定
取培养三天的菌液10000倍稀释涂布平板，观察不同形态菌落的数目以及总菌落数，并记录，求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中解磷解钾的细菌数目。
根据以上细菌的形态，革兰氏染色结果，运动性以及生理生化试验结果查看伯杰氏手册对纯种细菌做出鉴定。
B.霉菌的筛选，分离纯化及鉴定
1霉菌的培养
1）涂布
配制钾长石固体培养基，115度灭菌20分钟，冷却至不烫手，无菌操作加链霉素（1mL/1000mL）倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，然后用移液枪吸取土壤稀释液对好放入已做好标记的平板中央位置，每皿准确放入0.1ml，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；
2）培养
将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；
2.霉菌的分离纯化
操作步骤同细菌
3.小室培养法鉴定霉菌
1）灭菌准备
制作4个平皿，在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U形玻棒，其上放一洁净载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油，加塞包好；最后取10mL移液管两支用牛皮纸包好。
2）灭菌
将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min（由于培养基中有葡萄糖，为防止由于高温而使糖发生糊化而变质，灭菌温度不宜过高）。
3）制作琼脂薄片
在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL注入两个灭菌空平皿中，使之凝固成薄层。
在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～1.2cm×1～1.2cm的方格，通过无菌操作，用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块。
（注：
解剖刀使用前应先在酒精中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，冷却后再进行切割操作）
4）接种
在无菌操作台上，先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上，然后用解剖刀取一小块儿琼脂块，置于载玻片上（注意：
镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡，灼烧冷却后再进行下一步的操作），用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子，分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。
最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml灭菌的20%的甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖并贴标签，每一种菌接种两个小室。
5）恒温培养
将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天。
6）镜检
在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片，用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子。
7）保存菌种
实验结果
注：
1、2、3号菌选自
解钾培养基，4、5、6号菌选自
解磷培养基，
、
为所选解钾培养基中的霉菌。
A.细菌部分
10000倍稀释平板的细菌数目及形态
表1解钾细菌数目的测定
平板1
平板2
平板3
平均数
菌落数
32
7
10
16
透明圈数
26
1
2
-
1g土壤样品中解钾细菌数目为
表2解磷细菌数目的测定
平板1
平板2
平板3
平均数
菌落数
1
55
7
21
透明圈数
0
0
1
-
1g土壤样品中解磷细菌数目为
细菌的形态
解钾细菌（图中马克笔标注部分）
解磷细菌（图中马克笔标注部分）
细菌的基本形态
1号菌
单染色
革兰氏染色
2号菌
3号菌
单染色
革兰氏染色
4号菌
5号菌
单染色
革兰氏染色
6号菌
细菌的运动性（下面都是有运动性的细菌，没有运动性的细菌没有图片）
4号菌
5号菌
6号菌
根据上述实验观察结果得到的实验推断
根据伯杰氏手册设计的生理生化实验
1号菌
3号菌
6号菌
表3葡萄糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
颜色变化
紫色
黄色
是否产气
否
否
结论
该菌不分解葡萄糖或分解不产酸不产气
该菌分解葡萄糖或分解产酸不产气
最后可以确定，1号菌是微球菌，3号菌是志贺氏菌，4号菌是乳杆菌，6号菌是芽孢乳菌。
2号菌无法判断，5号菌可能是乳杆菌，也可能是利斯佳氏菌。
B.霉菌部分
霉菌形态观察
油镜观察
实验小结
（1）通过实验我们学习了微生物实验中较基本的操作技能，掌握了配置培养基的一般方法和步骤、从土壤中分离微生物的方法，对无菌操作技术有了一定的了解，同时使组员的合作更加高效、密切。
微生物实验讲究细心程度，在实验刚开始的时候，每个组在一些基本操作上出了不少问题，最常见的就是配错培养皿。
随着实验进行，我们组里每个人微生物实验基本操作得到了很好的规范和练习。
（2）在做关于分离实验时，无菌操作特别重要。
因操作不当很容易感染，使所做的平板或斜面失败，故操作前应先对所要使用的物品进行紫外线灭菌；操作时应严格遵守操作规程，勿将实验操作在无菌工作台外进行，避免因人为因素而使实验产生误差。
（3）掌握足够的理论知识是我们能够较好的理解和完成实验的一个先决条件。
因此，我们要学习好相关的理论知识，做好实验前的预习工作。
在这两个星期的微生物实验中，我们学到了很多知识。
上专业课也可以学到知识，但是，不会像在实验课上学得扎实、令人印象深刻。
这个，也是一位学姐告诉我们的。
参考文献：
沈萍陈向东《微生物学》2006年
沈萍陈向东《微生物学实验》2008年
《伯杰氏系统细菌学手册》（第4版）
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