第四节 动物细胞工程.docx

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第四节动物细胞工程

动物细胞工程

主讲：

黄冈中学优秀生物教师　严贻兰

一、知识概述

1、动物细胞培养；

2、动物体细胞核移植技术和克隆动物；

3、动物细胞融合与单克隆抗体。

二、重点知识归纳及讲解

（一）动物细胞培养

1、概念：

从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

2、过程

3、条件

4、植物组织培养与动物细胞培养的区别

项目

植物组织培养

动物细胞培养

原理

细胞的全能性

细胞的增殖

培养基状态

固体

液体

培养基特有成分

蔗糖、植物激素等

葡萄糖、动物血清等

结果

植物体

细胞株、细胞系

应用举例

作物新品种的培育；细胞产物的工业化生产等。

获得突变细胞系；生产生物制品；皮肤移植；检测有毒物质的毒性等。

（二）动物体细胞核移植和克隆动物

1、原理

　　动物细胞核的全能性。

动物细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。

用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。

2、供核细胞

　　一般选优良动物的传代培养10代以内的细胞。

3、受体细胞

　　去核的MⅡ期卵母细胞。

4、过程

5、应用

（1）加速家畜遗传改良进程，促进良种畜群繁育；

（2）保护濒危物种；

　　（3）生产医用蛋白；

　　（4）作为异种移植的供体；

　　（5）用于组织器官的移植。

（三）动物细胞融合与单克隆抗体

1、单克隆抗体的制备过程

运载药物（“生物导弹”—单抗导向，药物为弹头）

2、植物体细胞杂交与动物细胞融合的区别

比较项目

植物体细胞杂交

动物细胞融合

原理

细胞膜的流动性、细胞的全能性

细胞膜的流动性、细胞增殖

融合前处理

用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合

用胰蛋白酶使细胞分散后诱导细胞融合

促融方法

物理法、化学法

物理、化学法、生物法

过

程

第一步

原生质体的制备

融合亲本细胞的准备

第二步

原生质体的融合与筛选

动物细胞融合与两次筛选

第三步

杂种细胞的形成与培养

产特定抗体的杂交瘤细胞培养

第四步

杂种植株的鉴定

单克隆抗体的分离提纯

用途

获得杂种植株

制备单克隆抗体

典型例题

例1、某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行动物细胞培养。

下列说法正确的是（　）

A．在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理

B．细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞的呼吸

C．甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象

D．仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒

解析：

　　胃蛋白酶最适pH值接近于2，呈酸性，而细胞培养液的pH值接近于中性，所以不能用胃蛋白酶处理。

CO2的作用是调节细胞培养液的pH值。

由于存在细胞接触抑制现象，在原代培养过程中，会出现停止增殖的现象，需要传代培养获得细胞株和细胞系；病毒在活细胞内才能增殖，不能用培养细胞的培养液进行培养。

答案：

C

例2、利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。

下列相关叙述正确的是（　）

A．用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体

B．体外培养单个效应B（浆）细胞可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体

C．将等量效应B（浆）细胞和骨髓瘤细胞混合，经PEG诱导融合后的细胞均为杂交瘤细胞

D．利用该单克隆抗体与SARS病毒核衣壳蛋白特异性结合的方法可诊断出病毒感染者

解析：

　　经过特定抗原刺激后产生的效应B（浆）细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后，产生杂交瘤细胞，杂交瘤细胞所产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。

在细胞融合过程中，可产生三种类型的杂交细胞，要进行筛选；利用抗原—抗体反应可用来诊断出病毒感染者，是一种常用的诊断方法。

答案：

D

例3、科学家通过对鼠和人控制抗体产生的基因进行拼接，实现了对鼠源杂交瘤抗体的改造，生产出对人体的不良反应减少、效果更好的鼠—人嵌合抗体，用于癌症治疗。

下图表示形成鼠—人嵌合抗体的过程。

请据图回答：

（1）鼠源杂交瘤抗体就是从免疫小鼠的脾脏细胞中获取B淋巴细胞，在诱导剂的作用下与______________融合，形成________细胞，并通过体内培养或体外培养生产单克隆抗体。

这种抗体与普通血清抗体相比较，最主要的优点在于它的________________________，可大量制备。

（2）与植物原生质体的融合相比，动物细胞融合在诱导融合方法方面的主要区别是还常用____________诱导融合。

　　（3）生产单克隆抗体一般不直接培养浆细胞，主要原因是________________。

　　（4）科学家通过基因拼接，将鼠源抗体基因改造成鼠—人嵌合抗体基因，然后导入到鼠淋巴细胞中，这个过程中用到的工具酶有________、________，改造抗体属于________工程的范畴。

答案：

（1）骨髓瘤细胞　　杂交瘤　　特异性强、灵敏度高　

（2）灭活病毒

（3）浆细胞不能无限增殖　

（4）限制酶　　DNA连接酶　　蛋白质

-返回-

同步测试

一、选择题

1、下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是（　）

A．培养基成分不同

B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行

C．动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能

D．动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株

2、在生物工程中一般都要用到酶，下列酶中属于动物细胞工程最常用的工具酶的是（　）

A．限制酶　　　　　　　　　　B．DNA连接酶

C．果胶酶　　　　　　　　　　D．胰蛋白酶

3、下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是（　）

A．培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞

B．克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变

C．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的

D．恶性细胞系的细胞可进行传代培养

4、在克隆多利羊的过程中，下列哪项技术没有运用到（　）

A．细胞培养技术　　　　　　　B．细胞核移植

C．胚胎移植技术　　　　　　　D．基因工程技术

5、用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是（　）

A．将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞

B．用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞

C．用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合

D．筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体

6、下列关于动物胚胎移植的叙述中，错误的是（　）

A．受孕母畜体内的受精卵或胚胎均能移植

B．受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态

C．超数排卵技术要使用一定的激素

D．试管婴儿只是受精及早期卵裂过程在试管中进行

7、近日名为“我的皮肤”的生物活性绷带在英国诞生了，它给皮肤烧伤病人带来了福音。

该活性绷带的原理是先采集一些细胞样本，再让其在特殊的膜片上增殖。

5～7天后，将膜片敷在患者的伤口上，膜片会将细胞逐渐“释放”到伤口，并促进新生皮肤层生长，达到加速伤口愈合的目的。

下列有关叙述中，不正确的是（　）

A．“我的皮肤”的获得技术属于动物细胞培养

B．人的皮肤烧伤后会因人体第二道防线的破坏而导致免疫力下降

C．种植在膜片上的细胞样本最好选自患者本人

D．膜片能否把细胞顺利“释放”到伤口与患者自身皮肤愈合和细胞识别有关

8、关于单克隆抗体的生产和应用，错误的是（　）

A．对小动物注射特定抗原以获取所需的B细胞

B．融合并筛选特定的杂交瘤细胞，原代培养产生遗传物质改变后才能进行传代培养

C．特定的单克隆抗体可制成试剂，用于检测人体是否受某种抗原的感染

D．治疗癌症的“生物导弹”原理之一是利用单克隆抗体的特异性识别癌细胞

9、生物技术的发展速度很快，已灭绝生物的“复生”将不再是神话。

如果世界上最后一只野驴刚死亡，以下提供的“复生”野驴个体的方法中能够成功的是（　）

A．将野驴的体细胞取出，利用组织培养技术，经脱分化、再分化，培育成新个体

B．将野驴的体细胞两两融合，再经组织培养培育成新个体

C．取出野驴的体细胞核移植到母家驴的去核卵细胞中，经孕育培养成新个体

D．将野驴的基因导入家驴的受精卵中，培育成新个体

10、卵细胞作为生殖细胞，在生物技术中可用于（　）

①克隆动物时细胞核的受体

②进行体外受精，培育试管动物

③形成受精卵，作为培育转基因动物的受体细胞

④植物组织培养形成可育的二倍体试管苗

⑤形成受精卵，利用转基因和植物组织培养，培育抗虫棉植株

A．①②③④　　　　　　　　　　B．③④⑤

C．①③⑤　　　　　　　　　　　D．①②③⑤

显示提示

提示：

　　1、A　解析：

考查动物细胞培养与植物组织培养的主要区别。

动物细胞培养与植物组织培养有许多相似之处，也有许多不同点。

其主要不同点是它们的培养基的成分不同。

动物细胞培养的培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素，另外还有动物血清。

植物组织培养所需要的培养基包含植物生长和发育的全部营养成分，如矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物，没有动物血清。

　　2、D　解析：

基因工程用到的是限制酶和DNA连接酶；植物体细胞杂交技术用到的是纤维素酶和果胶酶；动物细胞工程用到的是胰蛋白酶，它的作用是使动物组织中的细胞相互分散成为单个的细胞，便于在液体培养基中培养。

　　3、D

　　4、D　解析：

考查克隆羊产生的过程。

多利羊的培育过程是：

将一只母羊（A羊）卵细胞的细胞核吸出，得到不含核的卵细胞。

然后，将实验室中培养的另一只母羊（B羊）的乳腺上皮细胞的细胞核注入到无细胞核的卵细胞中并进行电刺激，这样就通过核移植技术形成了一个同时含有A羊核遗传物质和B羊细胞质的重组卵细胞。

融合后的卵细胞经过体外细胞培养形成早期胚胎。

然后把这个胚胎移植到第三只羊（C羊）的子宫中，让C羊为胚胎发育提供发育场所和营养物质，这个过程利用了胚胎移植技术。

胚胎就在C羊子宫内发育成熟。

C羊产下的羊就是克隆羊多利。

从以上分析可以看出，多利产生的过程中没有使用基因工程技术。

　　5、B　　6、A　　7、B　　8、B　　9、C　　10、D

二、简答题

11、有性生殖的生物产生后代需经过受精作用，植物体细胞杂交要进行原生质体融合，单克隆抗体的制备需进行动物细胞融合，可见细胞融合技术有着广泛的应用。

下列为细胞融合的简略过程，据图回答相关问题：

（1）若a、b表示两种植物体细胞，则由d细胞形成杂种植株的原理是_____________，这种育种方法的优点是_______________。

（2）若a、b分别为骨髓瘤细胞和浆细胞，则d细胞特点是_______________________。

由d细胞产生的抗体与普通血清抗体相比较，具有______________________的特点。

生产上，一般不能通过直接培养浆细胞来生产单克隆抗体，其主要原因是_________________。

　　（3）下列各图表示单克隆抗体制备过程的各阶段图解，请用箭头把代表各图解的字母按单克隆抗体制备过程的顺序连接起来。

顺序是______________________________。

显示答案

　　11、

（1）植物细胞的全能性　　克服了远缘杂交不亲和的障碍

（2）既能无限增殖，又能产生特定的抗体　　　特异性强、灵敏度高　　　浆细胞不能无限增殖

　　（3）

　　解析：

植物体细胞杂交形成杂种植株的基本原理是细胞的全能性，此技术打破了种间生殖隔离，实现了远缘杂交。

杂交瘤细胞具备了浆细胞产生特异性抗体和瘤细胞无限增殖的特点，使得单克隆抗体的产生成为现实。

-END-

课外拓展

动物细胞培养技术是如何发展起来的？

　　1907年，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。

之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染。

1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。

1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。

1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。

1957年，格拉夫（Graff）用灌流技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。

1957年，杜尔贝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。

单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。

此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。

20世纪60年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。

20世纪80年代后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。

　　为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？

用酶消化的是什么物质？

　　细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。

　　分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。

同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。

　　用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。

用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。

-END-

高考解析

例、红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO）期间要生产流程如下图：

（1）图中①所指的是_______________技术。

（2）图中②所指的物质是_______________，③所指的物质是_______________。

（3）培养重组CHO细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞严物积累对细胞自身造成危害，应定期更换_______________。

（4）检测rhEPO外活性需用抗rhEPO单克隆抗体。

分泌单克隆抗体的_______________细胞，可由rhEPO免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。

答案：

（1）PCR　　

（2）mRNA；rhEPO　　（3）培养液　　（4）杂交瘤

解析：

　　本题主要以人红细胞生成素生产为材料来考查基因工程和细胞工程中动物细胞培养技术、制备单克隆抗体技术。

获取目的基因的方法有四种（从基因文库中获取、用PCR扩增技术、用反转录法、用化学合成法）由图以核DNA为模板获得目的基因的方法可知①为PCR技术。

进行反转录的模板是mRNA。

由题意可知重组CHO细胞适用于生产重组人红细胞生成素（rhEPO），所以重组CHO细胞能过表达出重组人红细胞生成素（rhEPO）或者红细胞生成素。

培养动物细胞是用液体培养基——即培养液，细胞从培养液中吸收营养，并同时向培养液中排放代谢废物，当代谢废物积累时会危害细胞，因此要不断更新培养液。

制备单克隆抗体是让淋巴B细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，然后由杂交瘤细胞来分泌抗体。

-END-