Western Blot试剂的准备.docx

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WesternBlot试剂的准备

1.30%储备胶溶液：

丙烯酰胺（Acr）        29.0g

　　　　　　　　　　　亚甲双丙烯酰胺（Bis）      1.0g

混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2.4×分离胶缓冲液（1mol/LTris-HCl  PH8.8）  Tris  18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH8.8，定容至100ml。

3.4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl  PH6.8）  Tris  12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH6.8，定容至100ml。

4.10%SDS：

电泳级SDS10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH7.2，定容至100ml。

5.5×电泳缓冲液（PH8.3）：

    Tris    15.2g

                      甘氨酸  94g  

                      ddH2O    定容到1000ml

                      SDS    5g

　　先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。

6.10%过硫酸铵（AP）：

0.1g  AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。

7.2×加样缓冲液：

2×SDS加样缓冲液

　　　0.5mol/LTris-HCl（PH6.8）  2ml

　　　10%SDS            4ml

　　　β-巯基乙醇          1ml

　　　甘油              2ml

　　　1%溴芬蓝            1ml

　　　置4℃避光保存

8.TEMED：

注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用

9.转膜缓冲液（TowbintransferBuffer）：

即1×SDS-PAGE

10.0.01mol/LPBS（PH7.4）：

    NaCl          8.5g

　　　　　　　　　　　　　　　（12H2O）Na2HPO4    2.9011g

　　　　　　　　　　　　　　　（2H2O）NH2PO4      0.24g

　　　　　　　　　　　　　加ddH2O定容至    1000ml

11.封闭液:

                  1×PBS中加入          30ml

　　　　　　　　　　　5%（V/V）脱脂奶粉        1.5g

　　　　　　　0.02%叠氮钠          0.006g

　　　　　　　0.05%Tween-20          0.015g

12.漂洗液（PBST）：

含0.05%Tween-20的PBS溶液

　　每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-20

13.水饱和正丁醇：

正丁醇  50ml

　　　　　　　　　ddH2O    5ml    加入瓶中震荡，使结合，存于室温。

　　用时取上面一相加在凝胶上面。

14.考马斯亮蓝染色法试剂：

一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）

染色液：

90ml甲醇：

水（1：

1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。

（染色液多次回收利用）

　　　　　　　　　脱色液：

90ml甲醇：

水（1：

1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液

15.丽春红S染色色法试剂：

2%乙酸，

　　　　　　　　　　　　　0.5%丽春红的水溶液

　　脱色液：

TBS

16.Aprotinin:

为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。

17.PMSF：

在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。

一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。

凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。

18.显色液：

联苯胺显色液（DAB）

　　　　　DAB            2ml

　　　　　10%H2O2            60μl

　　　　　PBS（0.1mol/LPH6.4）  10ml

19.三去污裂解缓冲液

        0.5mol/LTris-HCl（PH8.0）      0.785g/100ml

        0.15mol/L  NaCl              0.8775g/100ml

        0.02%叠氮钠                0.02g/100ml

        0.1%SDS                  0.1g/100ml

超级详细配方：

SDS-PAGE、蛋白转印、WesternBlot试剂配制

（***整理，2004.9.6）

1.5mol/LTris（PH8.8）

1．称量181.7gTris置于1L烧杯中。

2．加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．用浓盐酸调节pH值至8.8。

4．定容至1L.

5．高压灭菌后，室温保存。

注意：

应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

（参照kara公司Catalog-N1）

1mol/LTris（PH6.8）

1．称量121.1gTris置于1L烧杯中。

2．加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

pH值

浓HCl

6.8

7.4

约70ml

7.6

约60ml

8.0

约42ml

4．定容至1L.

5．高压灭菌后，室温保存。

注意：

1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2.如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。

30％丙稀酰胺（100ml）

1．称量下列试剂置于烧杯中。

丙烯酰胺（Acrylamide）

29g

双丙烯酰胺（BIS）

1g

2．加入约60ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．定容至100ml,用0.45µm滤膜滤去杂质。

5．于棕色瓶中4oC保存。

注意：

1.丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。

聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

10％SDS

1．称量10g高纯度（电泳级）的SDS置于100~200ml烧杯中。

2．加入约70ml去离子水，68oC加热溶解。

3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。

4．定容至100ml，室温保存。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

10％过硫酸铵

1．称量1g过硫酸铵。

2．加入约10ml去离子水后搅拌溶解。

3．储存于4oC。

注意：

10％过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。

（参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

1×SDS凝胶加样缓冲液

50mmol/L

Tris·Cl（pH6.8）

100mmol/L

DTT

2%

SDS（电泳级）

0.1%

溴酚蓝

10%

甘油

不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1mol/LDTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。

（参照《分子克隆》二版P884）

本人将参照此配方，配成5×或6×，各成分浓度均扩大5倍。

另:

Takara公司Catalog-N5上的5×SDS－PAGELoadingBuffer配方：

组分浓度：

250mmol/L

Tris·Cl（pH6.8）

10%（W/V）

SDS（电泳级）

0.5%（W/V）

溴酚蓝（BPB）

50%（V/V）

甘油

5%（W/V）

β-巯基乙醇（2-ME）

配制量5ml

配制方法

1．称量下列试剂置于10ml塑料离心管中。

1MTris·Cl（pH6.8）

1.25ml

SDS（电泳级）

0.5g

溴酚蓝（BPB）

25mg

甘油

2.5ml

2．加去离子水溶解后定容至5ml。

3．小份（500ul/份）分装后于室温保存。

4．使用前将25ul的2-ME加到每小份中。

5．加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。

1mol/LDTT（20ml）

1．称取3.09gDTT，加入到50ml塑料离心管中。

2．加20ml的0.01MNaOAc（pH5.2），溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌。

3．分装后－20oC保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

3M醋酸钠（NaOAc）（100ml）

1．称取40.8gNaOAc·3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。

2．加冰醋酸调节pH值至5.2。

3．定容至100ml，高压灭菌后室温保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

0.01MNaOAc（pH5.2）

参照此配方配制。

5×Tris-GlycineBuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）

组分浓度：

0.125MTris,1.25MGlycine,0.5%（W/V）SDS

1．称量下列试剂置于烧杯中。

Tris

15.1g

Glycine

94g

10%（W/V）SDS（电泳级）

50ml

2．加入约900ml去离子水搅拌溶解。

3．定容至1L，室温保存。

（参照《分子克隆》二版P884）

TransferBuffer:

[自配]TransferBuffer:

500ml

25mMTrisbase,0.2Mglycine（甘氨酸）,20%methanol（甲醇PH8.5）

先配制1MTrisbase（MW:

121.1）100ml:

12.1gTrisbase+ddH2O至100ml,PH约11

1M12.5mlTrisbase+7.5gglycine（MW:

75.05）+100mlmethanol

+ddH2O至400ml,调好PH值，再加ddH2O至500ml.

先置于4oC保存备用。

（参照吴兴军给Protoco,据说优于《分子克隆》配方）

丽春红S储存液（10×）

丽春红S

2g

三氯乙酸

30g

磺基水杨酸

30g

加水至100ml。

用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液，使用后应予废弃。

10XTBS（Tris-bufferedsaline）:

Toprepare1literof10XTBS:

24.2gTrisbase,80gNaCl;adjustpHto7.6withHCl（useat1X）.

（参照CellsignalTechnologyProtoco）

WashBufferTBS/T:

1XTBS,0.1%Tween-20

[自配]WashBufferTBS/T:

1000ml

1×TBS,0.1%Tween-20,100ml10×TBS+1mlTween-20

+900mlddH2O

（参照CellsignalTechnologyProtoco）

BlockingBuffer:

1XTBS,0.1%Tween-20with5%w/vnonfatdrymilk。

[自配]Blockingbuffer:

150ml

for150ml,add15ml10×TBSto135mlwater,mix.Add7.5gnonfatmilkandmixwell.Whilestrirring,add0.15mlTween-20（100%）.

（现用现配，4oC储存备用）

（参照CellsignalTechnologyProtoco）

PrimaryAntibodyDilutionBuffer:

1XTBS,0.1%Tween-20with5%blockingagent;

for20ml,add2ml10XTBSto18mlwater,mix.Add1.0gBSAandmixwell.Whilestirring,add20µlTween-20（100%）.

（参照CellsignalTechnologyProtoco）