水质的细菌学检查.docx
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水质的细菌学检查
水质的细菌学检查
水质的细菌学检查
一、目的要求
（一）学习水质的细菌学检查法
（二）了解水质状况同细菌数量的关系及大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、基本原理
检测水中的细菌数量是评价水质状况的重要指标之一。
饮水是否合乎卫生标准，需要进行水中细菌数量及大肠菌群数量的测定。
大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细菌，由于大肠菌群是一群能发酵乳糖的革兰氏阴性、无芽孢杆菌，它们在乳糖培养基中经37℃培养24小时即能产酸、产气，所以常将其作为粪便污染的标志。
饮用水一般规定：
1毫升自来水中总菌数不得超过100个；1000毫升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料
培养基及器皿、牛肉膏蛋白胨培养基、乳糖蛋白胨发酵管（内倒置小管）、三倍乳糖蛋白胨发酵管（内倒置小管）、伊红美蓝琼脂培养基、无菌空瓶、无菌水、无菌培养皿、移液管、试管。
四、实验内客
（一）采取水样
1、自来水：
从学校各生活区取样。
先将自来水龙头用火焰灭菌,再开放水龙头使水流1—2分钟后，用无菌空瓶接取水样。
2、池水、湖水或河水：
用无菌空瓶取距水面10—15厘米深层水样。
水样采取后应立即检验，不得超过4小时。
（二）水中细菌总数测定
l、自来水：
稀释水样：
原水样和10-1水样，用无菌移液管分别吸取l毫升原水样和10-1水样，分别注入二个无菌培养皿中。
每皿各加13--15毫升已融化并冷却到45--50℃的牛肉膏蛋白胨培养基，轻轻旋转，使培养基与水样充分混匀，待凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱内，培养24小时进行菌落计数。
制作培养基方法、消毒灭菌、接种、计数皆参照参微生物学实验指导，具体如下：
培养基制作：
实验五、培养基的制备
培养基配方：
附录二、常用培养基之一
培养基灭菌：
实验六、灭菌与消毒
水样接种：
实验七、土壤微生物的分离与测数
细菌总数测定：
实验七、土壤微生物的分离与测数
2、池水、湖水或河水等。
稀释水样：
稀释倍数视水样污浊程度而定，使水样培养后每个平板中的菌落数在30--300之间的的稀释度最为合适。
例如：
取湖水稀释成10-1、10-2、10-3。
每个稀释度作两个培养皿，并依上法倾入培养基制成平板，培养，计数。
菌落计数方法：
（1）先计算同一稀释度的平均菌落数。
若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不应采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2代表全平板的菌数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落在30—300之间的平板，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表1中例1）。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数都在30--300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。
若其比值小于2则应取两者的平均数；若大于2则取其中较小的菌落总数（表1中例2及3）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（表1中例4）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（表1中例5）
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30--300之间。
则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（表一中例6）
表一计算菌落总数方法举例
例次
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度
菌落数之比
菌落数
10-1
10-2
10-3
1
2
3
4
5
6
1365
2760
2890
无数
27
无数
164
295
271
4650
11
305
20
46
60
513
5
12
1.6
2.2
1600或1.6*104
38000或3.8*104
27000或2.7*104
5.1*105
270或2.7*102
31000或3.1*104
（三）用发酵法检查大肠菌群
1、自来水：
分三个步骤进行检查
（1）初发酵试验：
在2个装有50毫升三倍乳糖蛋白胨发酵管中，各加入100毫升水样，在10支装有5毫升三倍乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10毫升水样。
混匀后37℃培养24小时。
（2）平板分离：
经24小时培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝平板上，于37℃培养18--24小时，将符合下例特征的菌落的一部分，进行涂片、革兰氏染色、镜检。
a．深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
b．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
c．淡紫红色，中心色较深的菌落。
（3）复发酵试验：
经涂片、染色、镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌时，则挑取该菌落的另一部分，再接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一发酵管的同类型菌落1---3个。
37℃培养24小时，结果若产酸产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据发酵试验的阳性管数查表二,即得大肠菌群数。
2．池水，湖水或河水等
分别取湖水10-2、10-1的稀释液及原水样各1毫升，加到装有10毫升普通乳糖蛋白胨发酵液试管中。
另取10毫升和100毫升原水样，分别加到装有5毫升和50毫升三倍乳糖蛋白胨发酵液的试管中。
以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
若证实有大肠菌群存在，则根据大肠菌群阳性管数查表三或表四即得每升水样中的大肠菌群数。
表二大肠菌群检数表
接种水样总量300毫升（100毫升2份,10毫升10分）
接种水样量（毫升）
每升水样中
大肠菌群数
100
10
1
0.1
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
+
-
+
<9
9
9
9.5
18
19
22
23
28
92
94
180
230
960
2338
>2380
表四大肠菌群检数表
接种水样总量11.1毫升（10毫升、1毫升、0.1毫升、0.01毫升各1份）
接种水样量（毫升）
每升水样中
大肠菌群数
10
1
0.1
0.01
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
+
-
+
<90
90
90
95
180
190
220
230
280
920
940
1800
2300
9600
23380
>23800
五、实验报告内容
（一）我校各生活区水样中，细菌总数每毫升多少？
经大肠菌群
检查每升水中含多少？
水源被污染，出现什么情况？
（二）在湖水（或河水）水样中细菌总数及大肠菌群数是多少？
不同区域取样有无区别，为什么？
六、思考题
（一）大肠菌群中的细菌种类一般并非是病原菌，为什么要选大
肠菌群作为水源被污染的指标？
（二）伊红美兰培养基中的哪些成分有助于我们鉴别大肠杆菌?
附录:
所需培养基配方
一、牛肉膏蛋白胨培养基：
（300ml/桌，用500ml三角瓶做）
牛肉膏3克
蛋白胨10克
NaCl5克
琼脂20克
自来水1000毫升
PH7.2---7.4
灭菌121℃，30分钟
二、乳糖蛋白胨培养液（单倍）（200ml/桌，用500ml瓷缸子做）
蛋白胨10克
牛肉膏3克
乳糖5克
NaCl5克
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1毫升
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及NaCl加热溶解于1000毫升蒸馏水中，调pH至7.2---7.4。
加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1毫升，混匀，分装于有倒置杜氏小管的试管中。
115℃灭菌20分钟。
三、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：
（600ml/桌，用1000ml瓷缸子做）
上述培养液中成分各按三倍量配制，蒸馏水仍为1000毫升。
四、伊红美兰培养基（200ml/桌，用300ml三角瓶做）
蛋白胨10克
乳糖10克
磷酸二氢钾2克
琼脂20克
蒸馏水1000毫升
*2%伊红水溶液20毫升
*0.5%美兰水溶液13毫升
pH7.2---7.4
灭菌115℃,20分钟
*为灭完菌再加
水质细菌学检查实验时间安排
第一次：
讲实验
第二次：
准备器皿、洗器皿、准备无菌水管、灭菌
第三次：
做培养基、采样、接种、初发酵实验
（第三次应在下午1时准时开始）
第四次：
平板计数、接种于伊红培养基中
第五次：
革兰氏染色、复发酵实验
第六次：
分析结果
水质细菌学检查需要器皿（共分六个组）
培养皿：
18副/组，配铁桶2个/组
试管架：
1个/组（能插入大试管的）
大试管：
22支/组，配塞子
小试管：
5支/组，配塞子
500毫升矿泉水瓶：
2个/组
150毫升三角瓶：
4个/组，配塞子
300毫升三角瓶：
1个/桌，配塞子（做伊红美兰培养基用）
500毫升三角瓶：
1个/桌，配塞子（做细菌培养基用）
100毫升容量瓶：
2个/组（灭菌）（接种水样用）
5毫升枪头：
5支/组（其中需灭菌3支）
1毫升枪头：
6支/组（全部灭菌）
50毫升量筒：
1个/组酒精灯：
1个/组
指形试管：
4支/组玻璃纸：
3张/桌
杜氏小管：
22支/组铁丝筐：
1个/组
瓷缸：
1000毫升1个/桌
500毫升2个/桌
玻璃棒：
2支/桌
pH广泛试纸：
1个/桌
凉开水：
1锅
洗衣粉
革兰氏染色盘：
1套/桌
所需试剂：
（实验室准备一份）
1NHCl：
（贮于棕色小试剂瓶中）
HCl（含量为38%）83.3毫升
蒸馏水916.7毫升
1NNaOH：
（贮于棕色小试剂瓶中）
NaOH40克
蒸馏水100毫升
2%伊红水溶液：
伊红2克
蒸馏水100毫升
0.5%美兰水溶液
美兰0.5克
蒸馏水100毫升
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
溴甲酚紫1.6克溶于100毫升95%乙醇中
pH广泛试纸：
一板
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