槲皮素通过内质网应激对宫颈癌裸鼠移植瘤增殖分化及凋亡的影响.docx

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槲皮素通过内质网应激对宫颈癌裸鼠移植瘤增殖分化及凋亡的影响

槲皮素通过内质网应激对宫颈癌裸鼠移植瘤增殖、分化及凋亡的影响

目的：

观察槲皮素（Quercetin,QUE）对宫颈癌裸鼠移植瘤代谢过程的影响，探讨槲皮素在宫颈癌裸鼠移植瘤增殖、分化及凋亡过程中的信号转导机制。

方法：

将20只建模成功的SPF级BALB/c雌性人子宫颈癌移植瘤生长的裸鼠随机分为对照模型组、QUE25mg/kg干预组、QUE50mg/kg干预组和QUE100mg/kg干预组，分别给予不同剂量QUE处理，16d后选取各组瘤组织进行后序研究。

检测不同剂量QUE对瘤组织体积及质量的影响，ELISA法检测内皮细胞粘附分子-1（endothelialcelladhesionmolecule-1,sICAM-1）含量变化，TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡率，蛋白印迹法（Westernblot）检测炎症相关因子单核细胞趋化因子-1（monocytechemotacticprotein-1，MCP-1）、基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloprotein-9，MMP9）、细胞间黏附分子-1（intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM1）的表达以及内质网应激指标PERK、磷酸化PERK（p-PERK）、真核起始因子2α（eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）、转录激活因子-4（ATF-4）、CHOP的蛋白水平变化。

结果：

与对照模型组比较，QUE25mg/kg干预组、QUE50mg/kg干预组和QUE100mg/kg干预组瘤质量及瘤体积显著降低（P<0.01），抑瘤率和肿瘤体积抑制率显著增加（P<0.01），且呈浓度依赖性。

sICAM1的表达水平呈QUE浓度依赖性降低（P<0.01）。

TUNEL法检测结果提示，与对照组相比，QUE干预组肿瘤细胞凋亡率较高（P<0.01），并呈浓度依赖性促进细胞凋亡。

Westernblot结果表明，与对照组相比，肿瘤细胞的炎症相关因子MCP-1、MMP9、ICAM1的蛋白表达水平呈QUE浓度依赖性显著降低（P<0.01）；肿瘤细胞的内质网应激指标PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4及CHOP的表达水平呈QUE浓度依赖性显著升高（P<0.01）。

结论：

内质网应激途径在宫颈癌裸鼠移植瘤的增殖、分化及凋亡过程中发挥重要作用，QUE可有效抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，可能和通过激活内质网PERK/eIF2α/CHOP信号通路存在紧密关联。

【关键词】槲皮素；裸鼠；宫颈癌；内质网应激；凋亡；

Theinfluenceofquercetinontheendoplasmicreticulumstressintheratmodelofcervicalcancerxenografts

【Abstract】ObjectiveToexploretheinfluenceofquercetinontheendoplasmicreticulumstressintheratmodelofcervicalcancerxenografts．MethodsAtotalof20cervicalcancerxenograftsBALB/cmicewererandomlydividedintothefollowinggroups:

①Controlgroup;②QUE25mg/kggroup;③QUE50mg/kggroup;④QUE100mg/kggroup.Firstly,after16daystreatment,wedetectedtheeffectofdifferentdosesofQUEontumorvolumeandquality,,thesICAM-1wasdetectedbyELISA,theapoptosisofcervicalcancerwasdetectedbyTUNELmethodandtheexpressionsofMCP-1、MMP9、ICAM1、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4andCHOPintheendoplasmicreticulumweredetectedbyWesternblot.ResultsComparedwiththecontrolgroup,tumorqualityandtumorvolumeweresignificantlyreducedintheQUEinterventiongroup（P<0.01）,andthetumorsuppressionrateandtumorvolumeinhibitionrateweresignificantlyincreased（P<0.01）,anditwasconcentration-dependent.TheexpressionlevelofsICAM1showedaconcentration-dependentdecreaseinQUEinterventiongroup（P<0.01）.TUNELassayshowedthattheapoptoticrateofcervicalcancerwashigherinQUEinterventiongroupthanthecontrolgroup（P<0.01）,andtheapoptosisratewasincreasedinadose-dependentmanner.TheWesternblotresultsshowedthatcomparedwiththecontrolgroup,theexpressionofMCP-1、MMP9、ICAM1、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4andCHOPincervicalcancerincreasedwithdose-dependentmanner（P<0.01）.ConclusionTheendoplasmicreticulumstresspathwayplaysanimportantroleintheproliferation,differentiationandapoptosisofcervicalcancernudemicexenografts.QUEcaneffectivelyinhibittumorcellproliferationandinduceapoptosis,possiblybyactivatingtheendoplasmicreticulumPERK/eIF2α/CHOPsignalingpathwayiscloselyrelated.

【Keywords】Quercetin;nudemice;cervicalcancer;endoplasmicreticulumstress;apoptosis

ThisworkwassupportedbythetheHealthIndustryResearchPlanProjectofGansuProvince（GSWSKY-2019-24）;theMilitaryMedicalScienceandTechnologyYouthDevelopmentProgram（19QNP047）;theHealthIndustryResearchPlanProjectofGansuProvince（GSWSKY2018-21）;Lan'ZhouTalentInnovationandEntrepreneurshipProject（2019-RC-65）,P.R.China.

*Correspondingauthor,TUOShu-mei,E-mail:

tutuhehtt@

宫颈癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤之一，在常见的恶性肿瘤中排名第二，为女性生殖系统中最多见的肿瘤[1]。

在因恶性肿瘤死亡的女性患者中，宫颈癌是主要的死因之一。

目前在中国每年大约有13.6万新发病例，占世界总数的28.5%，且其发病率有增长趋势，仅2015年新增宫颈癌人数高达约98900例，占全球发病率的18.7%，成为我国主要的公共卫生问题[2]。

如何抑制肿瘤生长、复发和转移、降低死亡率、延长患者的无病生存期及提高患者生活质量是当下国内外学者面临的关键挑战。

内质网（endoplasmicreticulum,ER）为细胞内蛋白质的合成、翻译、折叠修饰、运输的重要场所，在缺血缺氧、氧化应激等损伤刺激时可导致ER功能障碍，造成内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。

ERS主要包括PERK、ATF6、IRE1三条通路，其中PERK/eIF2α通路是细胞启动ERS的最先信号[3]。

ERS是否参与槲皮素对宫颈癌细胞增殖、分化及凋亡的代谢过程，目前报道较少。

本研究中我们尝试在槲皮素影响下，分别检测宫颈癌裸鼠移植瘤细胞活力、炎症相关因子以及内质网应激反应指标的改变，初步探讨槲皮素激活内质网应激相关的信号通路、进而促进肿瘤细胞凋亡的分子机制。

1材料与方法

1.1实验试剂

DMEM低糖培养液（购自美国Sigma公司），二甲亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（购自美国Sigma-Aldrich公司）；蛋白酶抑制剂、β-actin抗体（购自美国SantaCruz公司）；HRP羊抗小鼠、羊抗兔和兔抗羊IgG二抗（购自北京中杉金桥公司）；小牛血清（购自杭州四季青公司）；RIPA裂解液、蛋白上样缓冲液（购自上海碧云天生物公司）；、改良Eagle培养基（Dulbeccomodifiedeaglemedium，DMEM）低糖培养液（购自美国HycLone公司）；无血清细胞冻存培养基（RPMI1640；购自美国GIBCO公司）；RIPA蛋白质裂解液（购自美国Promab公司）；线TUNEL试剂盒（购自武汉博士德生物公司）。

1.2试验动物与细胞株

SPF级20只雌性BALB/c裸鼠，遗传背景H-2d，体重15.05-19.00g，平均16.80±2.50g，由兰州大学动物实验中心提供，饲养于SPF级屏障环境内，饲喂SPF级鼠料，饮水经实验动物饮用水处理器处理，动物自由采食和饮水，每周补充葵花籽两次，垫料经高压灭菌，每周更换两次，饲养室内每次换完垫料用84消毒液对地板及所用器具消毒，并且每两周用紫外线照射消毒1次。

研究经本单位动物伦理委员会批准（批准号：

2018KYLL-026）。

宫颈癌细胞株HeLa由兰州大学病理实验室惠赠。

1.3细胞培养、动物模型制备及分组

1.3.1细胞培养宫颈癌细胞株HeLa由兰州大学病理实验室惠赠。

将HeLa细胞置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养，设置孵箱条件为温度37℃，5%CO2，常规传代，取对数生长期细胞进行后序试验。

1.3.2动物模型制备取对数生长期HeLa细胞无血清培养基悬浮沉淀，在显微镜下计数，培养调整至HeLa细胞浓度为2×103个/ml，，染色观察活细胞数目大于90%。

在无菌环境下取HeLa悬浮细胞液，依次抽取0.2ml注入BALB/c裸鼠右侧大腿根部皮下，建立人宫颈癌HeLa细胞裸鼠模型，按文献［4］方法判断模型是否建立成功。

1.3.3动物模型分组建模成瘤时间约为4周，4周后，将建模成功的人宫颈癌HeLa细胞裸鼠分为4组，对照模型组、QUE25mg/kg干预组、QUE50mg/kg干预组和QUE100mg/kg干预组。

每组试验动物各5只。

各给药组按剂量腹腔注射给药，模型组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续给药16d。

1.3.4瘤组织体积、质量及抑瘤率给药第16d时停药24h后脱颈处理各组试验裸鼠，完整剥出肿瘤组织，在此期间，每间隔4d测量移植瘤体积，并绘制移植瘤生长曲线。

脱颈处理动物后称肿瘤体质量、肿瘤体体积并计算抑瘤率，公式如下:

抑瘤率（%）=1－（实验组平均瘤质量）×100%

对照组平均瘤质量

肿瘤体积抑制率（%）=1－（实验组平均瘤体积）×100%

对照组平均瘤体积

1.4ELISA法检测各组内皮细胞粘附分子-1水平

对各组剥出的瘤组织进行ELISA法检测，按照ELISA试剂盒说明书要求测定sICAM-1水平变化。

1.5TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡率

分别取各组裸鼠的瘤组织常规脱水、包埋、切片、脱蜡。

后按TUNEL试剂盒说明书操作，荧光显微镜照相，其中TUNEL染的凋亡细胞核发绿光，DAPI染的所有细胞核发蓝光。

以绿色荧光的细胞数与蓝色荧光细胞数的百分比（%）表示凋亡细胞数所占总细胞数的比例。

1.6蛋白印迹法检测MCP-1、MMP9、ICAM1及PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4和CHOP的表达水平

蛋白印迹法测定裸鼠肿瘤细胞中MCP-1、MMP9、ICAM1及PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4、CHOP的含量，聚丙烯酰胺凝胶电泳（BALB/cS-PAGE）进行电泳分离，半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭，洗膜，加入1∶600稀释的兔抗鼠MMP9、ICAM1及PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4、CHOP一抗，4℃下过夜，用洗膜液漂洗后加入1∶1000稀释的二抗，摇床1h，TBST冲洗三遍，每次5min，后用电化学发光（electrochemicalluminescence，ECL）液进行曝光显影，Bio-Rad照相系统拍照，上机检测用所带电脑软件进行条带灰度值的分析。

1.7统计学方法

采用SPSS16．0统计软件进行统计分析，所有实验数据均以均数±标准差（

）表示，各组数据比较前先进行方差齐性检验，各组总的组间差异比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），以Newman-Keuls检验进行组间的两两比较。

P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1裸鼠瘤体积、质量和抑瘤率的检测结果

与对照模型组（Control组）比较，QUE25mg/kg干预组、QUE50mg/kg干预组和QUE100mg/kg干预组瘤质量及瘤体积显著降低（P<0.01），抑瘤率和肿瘤体积抑制率显著增加（P<0.01）。

给药组之间比较，QUE25mg/kg干预组瘤质量及瘤体积降低最为明显（P<0.01），抑瘤率和肿瘤体积抑制率增加最为明显（P<0.01），且呈浓度依赖性。

表1,2，图1。

表1裸鼠瘤质量变化及抑瘤率的检测结果（

±s，n=5）

Tab.1Comparisonoftumormasschangeandtumorsuppressionrateinmice（

±s，n=5）

组别样本量（n）瘤质量（g）抑瘤率%）

对照模型组51.81±0.300

QUE25mg/kg干预组51.22±0.21a32.6a

QUE50mg/kg干预组50.76±0.15ab58.0ab

QUE100mg/kg干预组50.58±0.12abc67.9abc

aP<0.01vs.对照模型组，bP<0.01vs.25mg/kg组，cP<0.01vs.50mg/kg组

aP<0.01vs.Controlgroup，bP<0.01vs.25mg/kggroup，cP<0.01vs.50mg/kggroup

表2裸鼠瘤体积变化及抑瘤率的检测结果（

±s，n=5）

Tab.2Comparisonoftumorvolumechangeandtumorsuppressionrateinmice（

±s，n=5）

组别样本量（n）处理前瘤体积（mm3）处理前后体积（mm3）抑瘤率%）

对照模型组589.75±8.501089.50±122.950

QUE25mg/kg干预组590.08±8.32762.26±80.80a30.0a

QUE50mg/kg干预组589.72±9.01617.90±62.61ab43.3ab

QUE100mg/kg干预组590.05±9.10526.25±55.19abc51.7abc

aP<0.01vs.对照模型组，bP<0.01vs.25mg/kg组，cP<0.01vs.50mg/kg组

aP<0.01vs.Controlgroup，bP<0.01vs.25mg/kggroup，cP<0.01vs.50mg/kggroup

图1QUE对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的影响（n=5），aP<0.01vs.对照模型组，bP<0.01vs.25mg/kg组，cP<0.01vs.50mg/kg组

Fig.1EffectofQUEonthegrowthofcervicalcancerHeLacellinnudemice（n=5）,aP<0.01vs.Controlgroup,bP<0.01vs.25mg/kggroup,cP<0.01vs.50mg/kggroup

2.2ELISA法检测各组动物内皮细胞粘附分子-1水平

与Control组相比，QUE25mg/kg干预组、QUE50mg/kg干预组和QUE100mg/kg干预组sICAM-1含量表达水平均有统计学差异（P<0.01），且呈浓度依赖性降低QUE不同浓度组之间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

提示QUE干预后可使肿瘤细胞炎性因子表达水平降低，其中当QUE浓度为100mg/kg降低最为明显。

如图2。

图2不同剂量QUE处理对各组动物肿瘤细胞sICAM-1含量表达的影响。

结果用mean±SEM，n=5，aP<0.01vs.对照模型组，bP<0.01vs.25mg/kg组，cP<0.01vs.50mg/kg组

Fig.2TheeffectofdifferentdosesofQUEonnudemiceofsICAM-1expression.Theresultswithmean±SEM,n=5,aP<0.01vs.Controlgroup,bP<0.01vs.25mg/kggroup,cP<0.01vs.50mg/kggroup

2.3不同剂量QUE干预对各组动物肿瘤细胞凋亡率的影响

TUNEL检测各组肿瘤细胞凋亡率，如图所示，与Control组（7.10±1.50%）相比，QUE25mg/kg处理可显著增高肿瘤细胞凋亡率至16.60±2.20%（P<0.01），QUE50mg/kg处理显著增高肿瘤细胞凋亡率至28.00±3.65%（P<0.01），QUE100mg/kg处理显著增高肿瘤细胞凋亡率至35.25±4.20%（P<0.01）。

QUE不同浓度组之间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

提示QUE干预后可促使肿瘤细胞凋亡率增高，其中当QUE浓度为100mg/kg时促肿瘤细胞凋亡作用最为明显。

如图3。

图3不同剂量QUE干预对各组动物肿瘤细胞凋亡率的影响。

结果用mean±SEM，n=5，aP<0.01vs.对照模型组，bP<0.01vs.25mg/kg组，cP<0.01vs.50mg/kg组

Fig.3TheeffectofdifferentdosesofQUEontumorcellapoptosisratesinvariousgroups.Theresultswithmean±SEM,n=5,aP<0.01vs.Controlgroup,bP<0.01vs.25mg/kggroup,cP<0.01vs.50mg/kggroup

2.4各组动物肿瘤组织炎症相关因子MCP-1、MMP9及ICAM1蛋白表达水平变化

与Control组相比，QUE25mg/kg干预组、QUE50mg/kg干预组和QUE100mg/kg干预组中肿瘤细胞的MCP-1、MMP9及ICAM1蛋白表达水平变化均有显著统计学差异（P<0.01），且呈浓度依赖性降低；QUE不同浓度组之间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

提示QUE干预后可使肿瘤细胞的炎症相关因子MCP-1、MMP9及ICAM1蛋白表达水平降低，其中当QUE浓度为100mg/kg下降最为明显。

如图4。

图4不同剂量QUE干预对动物炎症相关因子MCP-1、MMP9及ICAM1蛋白表达变化影响。

结果用mean±SEM，n=5，aP<0.01vs.对照模型组，bP<0.01vs.25mg/kg组，cP<0.01vs.50mg/kg组

Fig.4TheeffectofdifferentdosesofQUEoninflammation-relatedfactorsMCP-1,MMP9andICAM1proteinexpression.Theresultswithmean±SEM,n=5,aP<0.01vs.Controlgroup,bP<0.01vs.25mg/kggroup,cP<0.01vs.50mg/kggroup

2.5各组内质网应激指PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4及CHOP蛋白表达水平变化

与Control组相比，QUE25mg/kg干预组、QUE50mg/kg干预组和QUE100mg/kg干预组中肿瘤细胞的PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4及CHOP蛋白表达水平变化均有显著统计学差异（P<0.01），且呈浓度依赖性升高；QUE不同浓度组之间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.01）。

提示QUE干预后可使肿瘤细胞的PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4及CHOP蛋白表达水平增高，其中当QUE浓度为100mg/kg升高最为明显。

如图5。

图5不同剂量QUE干预对内质网应激指标PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4及CHOP表达变化影响。

结果用mean±SEM，n=5，aP<0.01vs.对照模型组，bP<0.01vs.25mg/kg组，cP<0.01vs.50mg/kg组

Fig.5TheeffectofdifferentdosesofQUEonERSindexPERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF-4andCHOPproteinexpression.Theresultswithmean±SEM,n=5,aP<0.01vs.Controlgroup,bP<0.