抗体的精制.docx

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抗体的精制

抗体的精制

抗体的精制

环境中的大部分生物（包括病原生物）及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。

同样用抗原人工免疫实验动物、可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清

（antiserum）。

因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体．所以称多克隆抗体（polyclonalantibody）。

一个B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。

用免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合．在体外可以分离出许多单个B细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体（monoclonalantibody）。

随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库（antibodycombinatoriallibrary）筛选制备单克隆抗体；应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体（engineeringantibody），以及催化性抗体（catylaticantibody）等的全新的抗体。

第一节抗血清的制备

1．免疫动物

（1）抗原：

免疫动物是制备抗血清的第一步。

免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，抗原的用量视抗原种类及动物而异，一次注射小鼠可以少至几个微克，兔、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg／次至几百mg／次。

（2）佐剂及乳化：

佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放．以增加免疫刺激的效果。

佐剂有完全和不完全佐剂之分。

完全体剂加有灭活的分枝杆菌（如卡介苗）或棒状杆菌。

弗氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1：

2—4混合自行制备。

佐剂与抗原按1：

1的比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。

（3）

免疫动物：

常用于制备抗血清的动物有豚鼠、家兔、小鼠、大鼠、羊、马等。

动物接受免疫的剂量，小鼠为1.0—2.0mL，家免为2—4ml。

（4）抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。

（5）腹腔注射，肌肉注射，皮内注射和皮下注射适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答。

初次免疫和免疫加强注射均可使用。

静脉注射则只适用于可溶性抗原及分散的单细胞悬液．其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。

（6）初次免疫要保证2-3次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的IgG抗体。

两次免疫注射之间的时间间隔，一般3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔10—14d，大动物则在2月左右：

在免疫加强最后一次注射的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。

2．抗血清的采血与保存

（1）采血：

加强免疫的动物2—3次后，可通过耳静脉或眼球（小鼠）采血，进行抗血清效价测定。

当效价达到理想的高度后，可以采血。

采血方式可以从心脏直接取血。

也可通过动脉放血，待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。

（2）抗血清的保存：

将采血浆静置1-2小时，3000rpm离心，15分钟，取上层血清，56℃水浴30分钟，灭活后分装，-30℃冷冻保存。

第二节抗体的精制

1．盐析法：

除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。

为了避免这些蛋白质干扰抗体（免疫球蛋白）标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的抗体组分。

常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。

蛋白质在不同的盐浓度的溶液中其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水—蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。

蛋白质分子量越大沉淀所需盐浓度越低。

抗体在30％—50％饱和度的硫酸盐可析出，而白蛋白需在70％—80％饱和度才析出。

因此常用33％饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。

盐析时为了减少抗体变性，需在4℃进行、同时用缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。

盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。

2．离子交换法：

离子交换在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。

它对蛋白质的分辨率高，操作简易，重复性好，成本低。

按照离子交换的原理，蛋白质可从大量的缓冲液中被分离出来，所以此方法适于蛋白质的粗提物的初始纯化。

离子交换原理：

（1）蛋白质的等电点是进行离子交换层析的重要依据。

同等电聚焦电泳一样，离子交换层析法利用不同的蛋白质表面电荷性质的不同达到分离、纯化蛋白质的目的。

（2）进行离子交换层析的最佳溶液pH值一般与蛋白质的等电点相差一个单位。

这可使蛋白质的净电荷量既可保证将其结合在离子交换树脂上，又不需在洗脱时采用使洗脱的离子强度很大或原溶液pH值相差悬殊等苛刻条件。

（3）离子交换剂与蛋白质的结合。

离子交换剂以自身所带相反电荷与蛋白质的净电荷结合。

标准的离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。

DEAE等阴离子交换树脂侧链电荷为正。

CM等阳离子交换树脂侧链电荷为负。

若蛋白质所带净电荷为负，则需用阴离子交换树脂进行纯化。

反之则使用阳离子交换树脂。

（4）蛋白质纯化的一般程序。

蛋白质的离子交换层析是根据蛋白质与离子交换树脂的选择性结合。

蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱。

余下的蛋白质均结合在树脂上，但与树脂的亲和力各不相同，可用逐渐增加洗脱液中氯化钠浓度的方法将其逐一洗脱出来。

常用离子交换剂种类

常用离子交换剂有离户交换纤维素和离子交换葡聚糖。

目前主要根据离子交换剂的性能而分为阳离子交换剂，阴离子交换剂。

下表为常用的一些离子交换剂种类

3．亲和层析法：

亲和层析是利用生物分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。

如抗原和抗体，蛋白质A与一类抗体之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。

当把可结合的一对分子的一方（称配体）结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。

然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。

载体的选择

使配体固相化的不溶件性化合物称为载体。

用于亲和层析的理想载体应该具备下述持性：

1高度亲水，使固相配体易于同水溶液中的相应结合物接近；

2惰性载体，使载体的非专一性吸附尽可能小；

3具有相当量的化学基团可供活化，并在温和条件下能与较大量配体连接；

4有较好的物理化学稳定性．不易受周围条件（加PH、离子强度、温度、变性剂和去污剂等）的影响，

5具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过而增加配体的有效浓度；

6有良好的机械性能，利于控制层析速度，最好是均一的珠状颗粒。

7抗体纯化中常用的载体为琼脂糖凝胶，它是球状凝胶颗粒。

球状琼脂糖凝胶获水能力很强，物理和化学性质比较稳定。

它具有疏松的网状结构，可让分子量上百万的大分子产物自由通过。

因此用琼脂糖载体制成的亲和柱不但可以较长期的反复使用，而且可以采用蛋白变性剂作为洗脱大分子物质及彻底洗涤吸附物质的洗脱液。

缺点是琼脂糖经不起有机溶剂处理，也不能进行干燥（包括冷冻干燥）。

抗体纯化中常用的配体

1蛋白A：

蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白抗原成分，它是单一的多肽链．分子量为42000．分为5个片段，从N末端开始的4个由58一62个氨基酸残基组成的高度同源的片段。

每个片段都具有和IgG上的Fc段结合的活性，但就整个蛋白A分子而言，只能与2个Fc段结合，这种结合是一种疏水结合，可在一定条件下，将IgG从蛋白A解脱下来。

蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH反复处理的性能极性，并可采用高浓度的诸如尿素、盐酸胍或异硫氰酸钾等变性剂进行处理而不致受到永久性破坏，大多数抗体都能耐受短暂的低pH处理。

2蛋白G：

蛋白G是链球菌表面的一种蛋白，分子量为30000一35000，它对免疫球蛋白的吸附机制与蛋白A相似。

蛋白G对各种免疫球蛋白的吸附能力与蛋白A不同，故在抗体的纯化上可与蛋白A互补。

当某些抗体对蛋白A没有吸附能力时，它们往往会对蛋白G有吸附作用（表）。

3

抗原：

根据抗原和抗体能形成抗原—抗体复合物的特性，发展了免疫吸附技术。

将可溶性抗原用化学方法偶联到不溶性载体上，使之固相化．将相应的抗血清按层析法加入柱中，抗血清中相应的抗体就与抗原特异结合，其它蛋白成分随洗脱液流出。

再改变缓冲液的PH和离子强度，就可以使抗体和偶联在载体上的抗原分开而被洗脱下来，从而得到纯净的抗体。

层析条件的选择

1.亲和层析一般采用柱层析法。

2.在亲和吸附时，亲和柱使用的平衡缓冲液的组分、pH和离子强度都应选择亲和双方作用最强、最有利于形成复合物的条件。

根据生物大分子的特点，一般选取接近中性PH作为亲和吸附条件。

3.上柱时样品液一般应与亲和柱平衡缓冲液一致，通常是上柱前，样品先对平衡缓冲液进行充分透析。

4.上柱流速尽可能缓慢，对流出液需进行定量测定，以判断亲和吸附效率。

5.样品通过亲和柱后，用大量的平衡缓冲液洗去杂质，直至流出液中不含蛋白。

6.然后再用洗脱液洗脱，洗脱液能减弱配体和亲和物之间的亲和力，使该结合物完全解离。

7.洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在时为止。

再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡，加入防腐剂，存放于冰箱（4℃）中，以备下次再用。