毕业论文细菌感染斑马鱼研究.docx
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毕业论文细菌感染斑马鱼研究
存档日期:
2010年6月存档编号:
06243019
本科生毕业论文(设计)
论文题目:
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌
感染斑马鱼研究
姓名:
院系:
生命科学学院
专业:
生物技术
年级、班组:
06级3
(1)班
指导教师:
徐州师范大学生命科学学院印制
生命科学学院本科学生毕业论文(设计)任务书
设计(论文)题目细菌感染斑马鱼研究
专业、班级生物技术06生31学生姓名朱静榕
指导教师姓名、职称吕爱军副教授下发日期2009年12月1日
(任务起止日期:
2009年12月1日至2010年5月30日)
设计(论文)的主要内容与要求及其主要技术指标:
主要内容:
本实验以斑马鱼为研究对象,用细菌感染斑马,连续观察一个星期,统计致死率。
主要技术指标:
1.静水式试验
2.细菌对斑马鱼致病性症状的观察及记录
3.获得一星期的LC50
进度安排
序号
毕业设计(论文)工作进度
日期(起止周数)
%
1
收集有关实验资料,材料及实验方法摸索
4月14日-19日
5
3
细菌对斑马鱼致病性的预实验
4月27日—30日
10
4
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月3日-9日
10
5
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月11日—13日
10
6
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月14日—15日
10
7
细菌对斑马鱼致病性的预实验
5月16日—17日
20
8
细菌对斑马鱼致病性的正式实验准备
5月18日
5
9
细菌对斑马鱼致病性的正式实验
5月18—20日
5
10
完成实验总结和毕业论文
5月
15
同组设计(论文)者:
系意见:
签字:
年月日
学院负责人意见:
签字:
年月日
注:
1.此任务书由指导教师填写。
2.此任务书最迟必须在第七学期16周之前下达给学生。
3.此表由院收集存档,以备教务处检查。
徐州师范大学生命科学学院制
存档日期:
2010年3月存档编号:
06243019
生命科学学院本科生毕业论文(设计)
开题报告书
论文题目:
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌
感染斑马鱼研究
姓名:
朱静榕
院系:
生命科学学院
专业:
生物技术
年级、班组:
06级31班
指导教师:
吕爱军
徐州师范大学生命科学学院印制
生命科学学院毕业论文(设计)开题报告表
课题题目
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌感染斑马鱼研究
指导教师
吕爱军
职称
副教授
课题组成员
朱静榕
毕业生年级
06生31
完成时间
2010年4月14日
立
题
依
据
1.研究的目的和意义
目的:
检测弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌,对斑马鱼的致病性,并获得致死温度和致死剂量。
意义:
斑马鱼是一种亚热带观赏鱼类,具有个体小,产卵周期小,产卵量高,体外受精与发育等特点,同时由于其与人类基因组具有较高相似性,也具有较完整的获得性和天然细胞免疫系统。
本实验以斑马鱼为模式动物,分析大肠杆菌的的致病性。
2.国内外研究进展及分析
大肠杆菌(Escherichiacoli)革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。
周身鞭毛,能运动,无芽孢。
大肠杆菌是细菌,属于原核生物;具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌,菌落呈深紫色,并有金属光泽,可鉴别大肠杆菌是否存在。
大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
人体与大肠杆菌的关系:
在不致病的情况下(正常状况下),可认为是互利共生(一般高中阶段认为是这种关系);在致病的情况下,可认为是寄生。
该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强,55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。
在自然界的水中可存活数周至数月,在温度较低的粪便中存活更久。
当前大肠杆菌病给养禽业带来的损失越来越大,其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点,正困扰着基层广大养殖户和兽医工作者。
大肠杆菌具有很多毒力因子,包括内毒素,荚膜,〣型分泌系统,黏附素和外毒素等。
立
题
依
据
弗氏柠檬酸杆菌革兰氏阴性,通常以周生鞭毛运动。
兼性厌氧。
有呼吸和发酵两种类型的代谢。
在普通肉胨琼脂上的菌落一般直径2~4mm,光滑、低凸、湿润、半透明或不透明,灰色,表面有光泽,边缘整齐。
偶尔可见粘液或粗糙型。
氧化酶阴性。
接触酶阳性。
化能有机营养,能利用柠檬酸盐作为惟一碳源。
硝酸盐还原到亚硝酸盐。
没有赖氨酸脱羧酶。
不产生苯丙氨酸脱氨酶、明胶酶、脂肪酶和DNA酶。
不分解藻朊酸盐和果胶酸盐。
发酵葡萄糖产酸产气。
甲基红试验阳性
3.主要参考文献
[1]康白.与正常微生物群有关的新概念.中国微生态学杂志,1992,4(4):
1-5
[2]桂远明,何幽峰,吴垠等.生态制品(Jy10、Jy31复合制剂)饲料添加剂对提高鲤抗病力的研究.中国微生态学杂志,1994,6(6):
27-33
[3]JesseDM,MelodyNN.Zebrafishasamodelhostforstreptococcalpathogenesis.ActaTropica,2004,91
(1):
53-68
[4]PressleyME,PhelanIIIPE,EckhardWP,etal.Pathogen-esisandinflammatoryresponsetoEdwardsiellatardainfec-tioninthezebrafish[J].Developmental&ComparativeIm-munol,2005,29(6):
501-513
[5]陈 阳,吴 迪,陈雪燕,赵焕灿,扈鸿霞,CheickADiakite,方维焕*猪链球菌2型分离株对野生斑马鱼的致病性*动物医学进展,2008,29(6):
1-5
[6]濮俊毅,黄新新,陆承平,2007用斑马鱼检测猪链球菌2型的致病力,中国农业科学40(11):
2655-2658
研究内容
研究的主要内容:
1.弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌对斑马鱼毒性的实验
2.获得弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌对斑马鱼的致死率
3.实验期间斑马鱼的观察及记录
技术路线
和实施方案
1.购买斑马鱼,置于蒸馏水中饲养,同批次斑马鱼驯养一周。
2.参照参考文献,分批设计不同预实验浓度,温度大肠杆菌。
3.针对预实验结果,设计正式试验的浓度,温度。
保证实验条件与预实验及以下实验操作时条件一致。
4.实验开始后开始观察斑马鱼,记录鱼死亡数目,时间,并及时清理死鱼。
5.实验期间连续充气
预期结果
1.预实验获得实验的浓度,温度。
2.正式实验获得致死剂量。
3.获得鱼在试验期间各种现象,整理实验数据,计算结果。
4.撰写毕业论文一篇。
指导教师意见
(签名)年月日
院系意见
(签名)年月日
大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌感染斑马鱼研究
朱静榕指导老师:
吕爱军
(徐州师范大学生命科学学院,江苏徐州221116)
摘要:
以野生斑马鱼为实验动物模型,分别采用大肠杆菌(Escherichiacoli)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii),以细菌浓度108-1010cfu之间,在25℃、28℃饲养条件下进行感染试验。
结果表明,斑马鱼在25℃时,大肠杆菌浓度4.0×108的感染致死率为66.7%,半致死时间(LT50)为48h;浓度为4.0×109致死率为66.7%,LT50为20h;浓度1.6×1010致死率为100%,LT50为7min;在28℃,大肠杆菌浓度为4.0×109致死率为66.7%,LT50为15h;浓度为8.0×109致死率为66.7%,LT50为9h。
弗氏柠檬酸杆菌浓度4.0×1010时25℃致死率为66.7%,LT50为27h;浓度2.0×1010时,28℃致死率为66.7%,LT50为20h。
以上结果表明大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌可以感染斑马鱼,并与饲养温度,菌液浓度有关。
关键词:
大肠杆菌;弗氏柠檬酸杆菌;斑马鱼;致死率
EscherichiacoliandcitrobacterfreundiiinfectionofthezebrafishExperimentalStudy
ZHUjingrongSupervisor:
LVaijun
(SchoolofLifeSciences,XuzhouNormalUniversity,Xuzhou,Jiangsu,221116,China)
Abstract:
WildzebrafishasexperimentalanimalmodelswereusedtoE.coli(Escherichiacoli),Citrobacterfreundii(Citrobacterfreundii),tobetween108-1010cfubacterialconcentration,in25℃,28℃keepinginfectionundertheconditionsoftest.Theresultsshowthatzebrafishat25℃,theconcentrationof4.0×108E.coliinfectiondeathratewas66.7%,medianlethaltime(LT50)is48h;concentrationof4.0×109deathratewas66.7%,LT50was20h;concentrationof1.6×1010deathratewas100%,LT50was7min;at28℃,E.coliconcentrationof4.0×109deathratewas66.7%,LT50was15h;concentrationof8.0×109deathratewas66.7%,LT50was9h.Citrobacterfreundiiconcentrationof4.0×1010whenthedeathrateof25℃66.7%,LT50was27h;concentrationof2.0×1010hours,28℃deathratewas66.7%,LT50to20h.TheseresultssuggestthatE.coli,Citrobacterfreundiicaninfectzebrafish,andwithraisingthetemperature,bacteriaconcentration.
Keywords:
Escherichiacoli;citrobacterfreundii;zebrafish;Infection;Fatalityrate;
引言
本实验中所使用的大肠杆菌来自于健康禽类的肠道,肠道菌群的组成是多种多样的,而且每种细菌的数量及分布各不相同。
肠道内的细菌根据所起作用可以分为原籍菌群(Autochthonousflora)和外籍菌群(Allochthonousflora),或分为固有菌群和非固有菌群等[1]。
弗氏柠檬酸杆菌来自于鱼类肠道。
鱼类对原籍菌群及外籍菌群的免疫作用是不同的。
当肠道菌群进入斑马鱼肠道中,一些适应于肠道环境的种类(一般为厌氧菌)在肠道内成为优势种群,定植下来成为原籍群。
所以寄主的免疫活性细胞并不将它视为“非己”,因此并不引起或仅产生低水平的免疫反应。
相反,鱼类对外籍菌群的免疫反应是强烈的。
侵入人、动物体内的外籍菌很容易引起宿主产生抗体和致敏的免疫活性细胞。
鲤进食生态制品后,免疫力增强,其白细胞吞噬率、白细胞吞噬指数、E玫瑰花环形成率等指标明显高于对照组[2]
大肠杆菌(Escherichiacoli)革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。
周身鞭毛,能运动,无芽孢。
大肠杆菌是细菌,属于原核生物;具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强,55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。
在自然界的水中可存活数周至数月,在温度较低的粪便中存活更久。
当前大肠杆菌病给养禽业带来的损失越来越大,其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点,正困扰着基层广大养殖户和兽医工作者。
大肠杆菌具有很多毒力因子,包括内毒素,荚膜,〣型分泌系统,黏附素和外毒素等。
弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)革兰氏阴性,通常以周生鞭毛运动。
兼性厌氧。
有呼吸和发酵两种类型的代谢。
在普通肉胨琼脂上的菌落一般直径2~4mm,光滑、低凸、湿润、半透明或不透明,灰色,表面有光泽,边缘整齐。
偶尔可见粘液或粗糙型。
氧化酶阴性。
接触酶阳性。
化能有机营养,能利用柠檬酸盐作为惟一碳源。
硝酸盐还原到亚硝酸盐。
没有赖氨酸脱羧酶。
不产生苯丙氨酸脱氨酶、明胶酶、和DNA酶。
不分解藻朊酸盐和果胶酸盐。
发酵葡萄糖产酸产气。
甲基红试验阳性。
弗氏柠檬酸杆菌对河蟹的病原性、并导致其病理变化,药物对该菌的敏感试验及生产中药物治疗效果。
从垂死的病蟹肝胰脏中分离得到可疑病菌,经人工感染试验证实此菌导致健康蟹发病死亡。
该菌可导致河蟹的肝胰腺、鳃等发生病理变化,最终引起败血症而死亡[10]。
斑马鱼(Daniorerio)是一种亚热带观赏鱼类,具有个体小、产卵周期短、产卵量高、体外受精与发育等特点,同时由于其与人类基因组具有较高相似性,也具有较完整的获得性和天然细胞免疫系统[3],是国际标准化组织推荐的五大试验鱼种之一,试验得出的数据可以在国际上被认可。
斑马鱼作为遗传学、发育生物学研究的模式生物已经得到了较为广泛的应用[4]。
斑马鱼亦存在着较为完整的特异性免疫系统[5],而且体本实验以斑马鱼为实验动物,为今后可以通过控制水体的微生物的组成来提高鱼苗的成活率,或人为地添加某些定植力强的有益菌群,令其在鱼苗肠道内产生一定的定植抗力,从而为达到提高鱼体抗病力的目的提供一定的科学参考。
1材料与方法
1.1主要试剂
磷酸二氢钠产自于合肥工业大学化学试剂厂,蛋白胨产自北京双旋微生物培养基制品厂,牛肉浸膏来自于国药集团化学试剂有限公司,氯化钠来自无锡市亚盛化工有限公司,磷酸氢二钠来自于合肥工业大学化学试剂厂,琼脂粉来自于天津市福晨化学试剂厂。
1.2菌株与实验动物
实验所用的弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌由徐州师范大学生命科学学院微生物实验室分离鉴定,保存。
所用大肠杆菌菌株来自于禽类。
试验所用的斑马鱼为市场销售的蓝条纹斑马鱼,采用充分曝气的清水饲养,并在水循环和增氧条件下生活1周以适应环境。
1.3斑马鱼浸泡试验
1.3.1平板计数
将弗氏柠檬酸杆菌,大肠杆菌接种于LB液体培养基37℃振荡培养24小时,吸光度在之间,4000转/min离心10min,收集菌体,PBS洗1次,再离心一次,在原液浓度基础上稀释10-1—10-88个梯度,取最低浓度的菌液涂基本培养基平板,在37℃的培养箱中培养24h,计算平板上长出的菌落数即cfu;计算出菌液浓度。
1.3.2OD值的测定
用分光光度计在600nm波长下测定菌液的吸光度,即OD值。
每种菌共测定三个稀释倍数,即稀释2倍,稀释4倍,稀释10倍。
1.3.3斑马鱼创伤处理
用刀片在斑马鱼脊椎上轻轻划一伤口,制造创伤,可增加浸泡时的感染几率。
1.3.4浸泡斑马鱼
斑马鱼浸泡实验分为饲养温度25℃、28℃两组,对照组则浸泡等量0.65%氯化钠溶液。
用菌浓度108—1010cfu弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌细菌进行感染试验,每组3条,浸泡时间为10min或15min,各组分开饲养,定时观察斑马鱼的发病和死亡情况,连续观察5-7d,记录每条鱼的死亡时间,计算致死率和半致死时间(LT50)。
重复两次实验,取两次实验结果的平均值,以减少实验误差。
1.4细菌分离与鉴定
将死亡斑马鱼在70%L酒精中浸泡1min后,无菌条件下剖开腹部,用接种环沾取腹腔液接种至基本培养基平板。
在培养箱中37℃培养过夜后,用长出的菌落与相对应的菌落进行比较分析。
2结果与分析
2.1平板计数
将原大肠杆菌菌液稀释8个浓度梯度后涂平板,经37℃培养24h后,计数平板上的菌落数,取平均值后为4,即原菌液浓度为4×109cfu/ml,
同样弗氏柠檬酸杆菌:
平均值10,即原菌液浓度为10×109cfu/ml。
2.2菌液OD值
表1大肠杆菌在的OD值
Table1thebacteriaconcentrationOD
浓度
2.0×109
1.0×109
2.0×108
OD值
1.229
0.698
0.265
大肠杆菌菌液的OD值随浓度的降低而减小,浓度为2.0×109(稀释2倍),OD值为1.229,浓度为2.0×109(稀释4倍),OD值为0.698,浓度为2.0×108(稀释10倍),OD为0.265
表2弗氏柠檬酸杆菌的OD值
Table2thebacteriaconcentrationOD
项目
5.0×109
2.5×109
1.0×109
OD值
1.319
0.788
0.355
弗氏柠檬酸杆菌菌液的OD值随浓度的降低而减小,浓度为5.0×109(稀释2倍),OD值为1.319,浓度为2.5×109(稀释4倍),OD值为0.788,浓度为1.0×109(稀释10倍),OD为0.355。
2.3致死情况
表3饲养温度为25℃时,大肠杆菌对斑马鱼的致死率和时间
Table2Rearingtemperatureof25℃,themortalityrateandtimeofimmersioninzebrafishforE.coli
浓度
致死率
4.0×108(cfu/ml)
4.0×109(cfu/ml)
1.6×1010(cfu/ml)
10min
66.7%(2/3)
66.7%(2/3)
100%(3/3)
LT50
49h
20h
7min
大肠杆菌在25℃时,浓度为4.0×108(cfu/ml)时,致死率为66.7%,半致死时间为49h,浓度为4.0×109(cfu/ml)时,致死率为66.7%,半致死时间为20h,浓度为1.6×1010(cfu/ml)时,致死率为100%,半致死时间为7min。
表4饲养温度为28℃时,大肠杆菌对斑马鱼的致死率和时间
Table3Rearingtemperatureof28℃,themortalityrateandtimeofimmersioninzebrafishforE.coli
浓度
致死率
1.6×109(cfu/ml)
8.0×109(cfu/ml)
10min
66.7%(2/3)
33.3(1/3)
15min
66.7%(2/3)
66.7(2/3)
LT50
15h
9h
大肠杆菌在28℃时,浸泡15min,浓度为1.6×109(cfu/ml)时,致死率为66.7%,半致死时间为15h,浓度为8.0×109(cfu/ml)时,致死率为66.7%,半致死时间为9h。
表5弗氏柠檬酸杆菌的对斑马鱼的致死率和时间
Table5Rearingtemperature,themortalityrateandtimeofimmersioninzebrafishforcitrobacterfreundii
浓度、温度
15min
4.0×1010(cfu/ml)
25℃
2.0×1010(cfu/ml)
28℃
致死率
66.7(2/3)
66.7(2/3)
LT50
27h
20h
弗氏柠檬酸杆菌在25℃时,浓度为1.0×1010(cfu/ml)时,致死率为66.7%,半致死时间为27h。
在28℃时,浓度为2.0×1010(cfu/ml)时,致死率为66.7%,半致死时间为20h。
大肠杆菌:
当饲养温度为25℃时,浸泡时间为10min,菌液浓度为4×108cfu时,96h内致死率为66.7%,半致死时间49h;当浓度为4×109cfu时,96h内致死率为66.7%,半致死时间20h;浓度为1.6×1010cfu,10min致死率100%,半致死时间为7min。
在同一温度下,随着浓度的增大,半致死时间缩短;浓度为4×108cfu,4×109cfu时,致死率都为66.7%,但当浓度增大到1.6×1010cfu时,在浸泡的10min内,致死率为100%,致死率增大(见表3,4)。
而当饲养温度上升为28℃时,浸泡时间为15min,菌液浓度为4×109cfu,浸泡10min,96h内致死率为66.7%,,半致死时间为15h;浓度为8×109cfu,96h内致死率100%,半致死时间为9h。
在28℃下,浓度越高,致死率越高,半致死时间也缩短(见表3,4)。
弗氏柠檬酸杆菌:
当饲养温度为25℃时,浸泡时间为15min,菌液浓度为4.0×1010cfu时,96h致死率为66.7%,半致死时间27h;当饲养温度为28℃时,浓度为2.0×1010cfu,96h致死率66.7%,半致死时间20h。
25℃时菌液浓度为28摄氏度时菌液浓度的2倍,但28℃时的半致死时间却短于25℃时的。
(见表5)。
综上所述,菌浓度越高,斑马鱼越易被感染,菌浓度为8×109cfu,是研究大肠杆菌感染斑马鱼免疫的最佳浓度,菌浓度为2.0×1010cfu是研究感染弗氏柠檬酸杆菌对斑马鱼免疫的最佳浓度,且斑马鱼感染后在28℃饲养比在25℃现象更明显。
2.4斑马鱼的临床及病理变化
感染后死亡的斑马鱼伤口发红,腮部泛红,腹部膨胀,剖检观察到,肝脏呈现苍白色,腹腔内有较多积水,而空白对照组并无以上现象。
3.讨论
本实验中所使用的大肠杆菌来自于健康禽类,当饲养温度为25℃时,浸泡时间为10min,菌液浓度为4×108cfu时,致死率为66.7%(2/3),半致死时间49h,浓度为4×109cfu,致死率为66.7%(2/3),半致死时间20h,浓度为1.6×1010cfu,致死率100%(3/3),半致死时间为7min。
当饲养温度为28℃时,菌液浓度为8×109cfu,浸泡10min,致死率为66.7%(2/3),,半致死时间15h,浓度为4×109cfu,浸泡15min,致死率100%(3/3),半致死时间为9h。
同一温度下,菌液的浓度越高,半致死时间越短,致死率总体也是提高的。
不同温度,同一浓度下,28℃的半致死时间短于25℃时的。
但对于25℃时,浓度为1.6×1010cfu,在浸泡的10min内,实验鱼全部死亡,半致死时间为7min,这种情况与菌液浓度过高有关,由于浓度过高,鱼浸