学年同步备课套餐之生物选修1讲义第一章 第2课时 精品.docx
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第2课时 分离特定的微生物并测定其数量
[学习导航] 1.认识各种微生物形成的菌落特征。
2.学会利用涂布平板法分离、培养微生物，并能测定其数量。
3.掌握利用选择培养基分离特定微生物的方法。
[重难点击] 简述分离、培养微生物的方法及数量测定。
一、微生物分离和培养的基本理论
1.纯培养物培养
在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成单个菌落，即由一个微生物（如某种细菌）形成的单个菌落。
单个菌落即为纯培养物，可用于科学研究。
2.分离特定的微生物
（1）平板分离法
①概念：
能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落。
②分离、培养微生物最常用的培养基是琼脂固体培养基。
③类型：
平板分离法有多种，如涂布平板法、混合平板法等。
a.涂布平板法分离细菌：
将待分离的样品进行10倍系列稀释，取一定稀释度的样品0.1mL倒入预先制备好的培养基平板中，用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀，恒温培养一段时间，以获得单个菌落的方法。
b.混合平板法分离细菌：
将待分离的样品进行10倍系列稀释，取一定稀释度的样品0.1mL与熔化冷却至50_℃左右的培养基混合均匀，将混合液倒入无菌培养皿中制成平板，培养一段时间，以获得单个菌落的方法。
（2）选择培养分离
①概念：
科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。
这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。
②依据原理：
不同的微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。
③举例
a.要分离耐高温菌，可在高温条件下进行培养。
b.要分离对某种抗生素具有抗性的菌种，可在加有该抗生素（如链霉素或青霉素）的平板上进行分离。
c.在培养基中加入质量分数为10%的酚，可以抑制细菌和霉菌的生长。
d.运用将纤维素作为唯一碳源和能源的培养基，可以有效地分离能分解纤维素的细菌。
e.运用无氮培养基（培养基完全不含氮元素），可选择能固氮的细菌。
f.运用只含尿素而不含其他氮元素的培养基，可以选择能分解尿素以获取氮的微生物（能合成脲酶的微生物可以分解尿素）。
3.观察各种微生物形成的菌落
（1）菌落：
指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
（2）菌落特征：
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。
1.如何从众多微生物中分离某种微生物，所利用的原理是什么？
答案 根据微生物所需营养物质、氧气、pH不同利用选择培养基选择。
2.结合教材完善下图中两种分离和纯化微生物的平板分离法并思考：
（1）涂布平板法的实质是什么？
答案 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。
（2）试比较两种分离和纯化方法
项目
操作
特点
结果
涂布平板法
取一定稀释度的样品涂布平板
↓
用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀
先制作平板后加入菌液
细菌菌落通常仅在平板表面生长
混合平板法
取一定稀释度的样品与熔化的培养基混合
↓
将与样品混合后的培养基倒入无菌培养皿
菌液与培养基混合，共同倒平板
细菌菌落出现在平板表面和内部
3.选择培养分离所利用的培养基是什么培养基？
它利用的原理是什么？
答案 选择培养分离所利用的培养基是选择培养基。
它利用的原理是不同的微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。
4.通常以菌落的哪些表观特征来对微生物进行分类、鉴定等？
答案 菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等。
归纳总结
（1）菌落的特征：
菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等。
每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。
这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义。
（2）选择培养基筛选微生物的方法
①在培养基中加入某种化学物质。
②改变培养基中的营养成分。
③改变微生物的培养条件。
（3）平板划线法和涂布平板法的比较
项目
优点
缺点
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
1.下列有关涂布平板法，叙述错误的是（ ）
A.首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
C.在适宜条件下培养
D.结果都可在培养基表面形成单个的菌落
答案 D
解析 涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
用不同稀释度的菌液接种，只有在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，才能够在培养基表面形成单个菌落，而不是所有培养基上均可出现单个菌落。
一题多变
（1）移液时需要注意哪些问题？
答案 移液管也需经过灭菌。
操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处，吸管头不要接触任何其他物体。
（2）如何处理涂布器？
答案 将涂布器浸在盛有70%酒精的烧杯中，取出时，让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2.从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：
采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。
培养嗜盐菌的菌样应从________（填“高盐”或“低盐”）环境采集，培养厌氧菌的菌样应从________（填“有氧”或“无氧”）环境采集。
（2）富集培养指创设仅适应于该条件的微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需的特定微生物目的的微生物培养方法。
对嗜盐菌富集培养的培养基应是________培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择__________________的培养基，并在________条件下培养。
（3）实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。
高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生________。
________灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。
（4）如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是_______________________________________________；
获得图B效果的接种方法是_______________________________________________。
答案
（1）高盐 无氧
（2）加盐 以淀粉为唯一碳源 高温
（3）变性 高压蒸汽
（4）涂布平板法 平板划线法
解析
（1）在长期自然选择的作用下，生物与其生活环境相适应，培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境中采集，培养厌氧菌应从无氧环境中采集。
（2）对嗜盐菌富集培养的培养基应是加盐培养基，对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基且在高温条件下培养。
（3）高温能使蛋白质和核酸发生不可逆转的变性，高压蒸汽灭菌法是应用最广、效果最好的湿热灭菌法。
（4）从培养基中菌落分布看，获得图A用的是涂布平板法，获得图B用的是平板划线法。
二、以尿素为唯一氮源的土壤微生物的分离、培养与数量测定
1.原理：
采用唯一氮源为尿素的选择培养基来培养。
分离出能在此培养基中生长、繁殖的微生物。
2.实验流程
采集土壤，制备悬液：
制备系列稀释液
↓
选择培养：
采用选择培养基培养
↓
接种：
涂布平板
↓
培养与观察
↓
计数菌落：
选取菌落数为30～300的一组为样本进行统计
3.显微镜直接计数法
（1）原理
①此法利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量，但不能区分细菌的死活。
②血球计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的容积为1×1×0.1mm3的计数室。
计数室的规格有两种，分别是25×16个小方格或16×25个小方格。
但两种规格的计数室都是由400个小格组成的。
具体如下图：
（2）操作
①将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物培养液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让培养液沿着缝隙通过毛细渗透作用自动进入计数室。
②加样后静置5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，再换成高倍镜进行观察和计数。
（3）计数
①若规格为16×25型的血球计数板，则在计数室内选4个中方格（如图中加黑点的左上、右上、左下、右下四个角）中的菌体进行计数。
②若使用规格为25×16型的血球计数板，则在计数室内选5个中方格（四个角和中央的方格）中的菌体进行计数。
③对位于格线上的菌体，一般只统计上方和右边格线上的。
④求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。
计算公式如下：
每mL原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数。
（4）使用完毕后，将血球计数板用水反复冲洗干净，切勿用硬物洗刷。
洗完后自然晾干即可。
1.筛选分解尿素的细菌的选择培养基
下面是筛选分解尿素的细菌使用的培养基的配方，请分析：
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
琼脂
15.0g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
答案 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
（2）分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
答案 该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
（3）为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
答案 分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物生长提供氮源。
2.下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答下列问题：
（1）试写出分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程。
答案 土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。
（2）统计菌落数目
甲、乙两位同学用涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。
在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
①甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？
为什么？
答案 不真实。
为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
②乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。
该同学对实验结果的处理是否合理？
为什么？
答案 不合理。
微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。
③某同学在三种稀释度下吸取0.1mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1g样品的活菌数。
平板
稀释度
平板1
平板2
平板3
104
320
360
356
105
212
234
287
106
21
23
18
答案 105的稀释度下取0.1mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为（212＋234＋287）/3≈244。
进一步可以换算出1g样品中活菌数为（244÷0.1）×105＝2.44×108。
④为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？
答案 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
归纳总结 分离尿素分解菌操作中的注意事项
（1）在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
（2）样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀释液。
（3）为排除非测试因素（培养基）的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。
（4）每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。
3.下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是（ ）
A.用全营养牛肉膏蛋白胨培养基筛选大肠杆菌
B.用高NaCl的培养基筛选抗盐突变菌株
C.含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株
D.利用高温条件筛选耐热的Taq细菌
答案 A
解析 全营养牛肉膏蛋白胨培养基常用于大肠杆菌的培养，该培养基对微生物无选择作用，A项错误；抗盐突变菌株具有耐高盐的能力，因此可以利用高NaCl的选择培养基进行选择培养，B项正确；分解尿素的菌株会分解尿素形成氨，使培养基pH升高，因此可以利用含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株，C项正确；利用高温条件可以筛选耐热的Taq细菌，D项正确。
4.自然界中的微生物往往是混杂生长的。
人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。
下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答下列有关问题：
（1）实验步骤
①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
②为了得到更加准确的结果，应选用__________法接种样品。
③适宜温度下培养。
（2）结果分析
①测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是__________。
A.一个平板，统计的菌落数是230
B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240
C.三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289
D.四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240
②一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是（涂布平板时所用的稀释液体积为0.2mL）__________。
③用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量__________（填“多”或“少”），因为__________________________________________________。
答案
（1）②涂布平板
（2）①D ②1.06×109个
③多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
解析
（1）若对大肠杆菌进行计数，则需要用涂布平板法接种样品。
（2）①应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。
②212÷0.2×106＝1.06×109（个）。
③因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
一题多变
（1）如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中测定的数值高还是低？
为什么？
答案 低。
因为稀释倍数太低，则大部分菌落是由多个细菌繁殖而成，所以测定的菌落的数值要偏低。
（2）第
（2）问第①小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。
答案 a.培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；b.接种过程中由于操作不当感染了杂菌；c.取菌液时没有摇晃，导致所取菌液中细菌个体浓度偏大等。
方法链接
用涂布平板法计数微生物的注意事项
（1）涂布平板操作要求：
按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
（2）计数的时机：
当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
（3）选择可用于计数的平板：
选择菌落数在30～300之间的平板（相同稀释度的平板均符合该特点）进行计数，然后取平均值。
三、分离土壤中能分解纤维素的微生物
1.原理
（1）土壤中能分解纤维素的微生物，都能分泌纤维素酶，将纤维素分解成小分子糖类物质以满足自身生命活动的需要。
（2）培养基：
以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
2.纤维素分解菌的鉴定：
刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来说明菌落是由能分解纤维素的细菌形成的。
其原理是：
纤维素分解菌
↓
→红色复合物
红色消失，出现透明圈
1.鉴别纤维素分解菌的培养基
（1）鉴别纤维素分解菌时需在培养基中添加什么物质？
答案 刚果红染色剂。
（2）鉴别培养基和选择培养基在目的和物理性质方面的区别是什么？
答案 ①鉴别培养基是在培养基中加入某些特定的作用底物和指示剂，观察微生物生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别微生物；选择培养基是在培养基中加入某些物质，以促进目的菌的生长繁殖，同时抑制其他杂菌的生长繁殖。
②选择培养的培养基中没有加入琼脂，所以属于液体培养基，而鉴别培养基一般为固体培养基。
2.透明圈的形成
（1）对分离的纤维素分解菌作进一步的鉴定的原因是什么？
答案 产生透明圈的菌落可能是能产生纤维素酶的微生物，也可能是能降解刚果红的菌种，所以需要进一步鉴定。
（2）简要概述筛选纤维素分解菌时透明圈是如何形成的。
答案 纤维素分解菌分解纤维素产生的纤维二糖和葡萄糖，不能与刚果红形成红色复合物，而出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）向含有分解尿素的细菌的培养基中加入酚红指示剂，会出现类似的圈吗？
答案 分解尿素的细菌能够将尿素分解成氨，加入酚红指示剂后会变红，也会形成以尿素分解菌为中心的红色的圈。
5.分析下表培养基的配方，请回答下面的问题。
纤维素分解菌的选择培养基：
组分
含量
纤维素粉
5g
NaNO3
1g
Na2HPO4·7H2O
1.2g
KH2PO4
0.9g
MgSO4·7H2O
0.5g
KCl
0.5g
酵母膏
0.5g
水解酪素
0.5g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。
（1）此培养基配方中为微生物提供碳源的主要是___________、氮源是________________。
（2）此配方为__________培养基（根据物理状态）配方。
（3）此培养基选择出的微生物主要是_____________________________________。
问题导析
（1）该培养基中纤维素是主要的碳源，所以可以用于筛选纤维素分解菌。
（2）由于该培养基中没有加入琼脂，所以为液体培养基。
该培养基中微生物与营养成分的接触更充分，可以提高微生物的代谢效率。
答案
（1）纤维素粉 NaNO3、酵母膏、水解酪素
（2）液体 （3）纤维素分解菌
解析 该培养基的主要碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏、水解酪素。
因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。
因该培养基仅以纤维素粉为主要碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。
一题多变
（1）从土壤中分离纤维素分解菌时，哪种情况下可以省略选择培养？
答案 当土壤中纤维素分解菌的浓度很高时，可以省略选择培养这一步骤。
（2）本题中的培养基配方中的酵母膏可以为微生物提供什么成分？
答案 可以提供碳源、氮源和生长因子。
（3）该培养基中纤维素是否为唯一的碳源？
答案 不是，纤维素是主要的碳源，另外，酵母膏和水解酪素也可以提供少量的碳源。
6.下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是（ ）
A.刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入
B.刚果红可以在菌落形成后加入
C.刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌
D.在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌
答案 C
解析 刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。
易错易混
关于纤维素分解菌筛选的三个易错警示
（1）纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素，其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
（2）在纤维素分解菌的选择培养基中生长的不只有纤维素分解菌。
因此，选择培养后要进行鉴别培养，才能获得纤维素分解菌。
（3）出现透明圈的菌落也不一定是纤维素分解菌。
1.菌种鉴定的重要依据是（ ）
A.细菌的大小、形状和颜色B.菌落的大小、形状和颜色
C.有无鞭毛D.培养基的不同
答案 B
解析 不同种类的微生物所形成的菌落在大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等方面具有一定的差异。
所以，在一定条件下所形成的菌落，可以作为微生物鉴定的重要依据。
单个的细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征不能作为菌种鉴定的依据。
2.用涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在加入10－5g/mL土壤悬液的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是（ ）
A.涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
答案 D
解析 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验结果的说服力与准确性。
C项虽涂布了三个平板，但是，其中一个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。
因此，不能简单地将三个平板的计数值用来求平均值。
3.根据生物与环境的相互依存关系，下列寻找目的菌株的思路不正确的是（ ）
A.从热泉中寻找耐热菌
B.从成熟的葡萄皮上寻找酵母菌
C.从贫瘠的土壤中寻找分解尿素的细菌
D.从树林的腐殖土中寻找分解纤维素的细菌
答案 C
解析 贫瘠的土壤中尿素含量少，应从富含尿素的环境中寻找分解尿素的细菌。
4.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经过细菌分解，就不能更好地被植物利用。
生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）。
培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。
请分析回答下列问题：
琼脂
15g
尿素
1g
葡萄糖
10g
MgSO4·7H2O
0.2g
Na2HPO4
2.1g
KH2PO4
1.4g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）培养基中加入尿素的目的是筛选_____________，这种培养基属于__________培养基。
（2）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的____________和_____________，实验需要振荡培养，目的是_____________________________________________。
（3）转为固体培养基时，常采用__________________的方法接种，获得单菌落后继续筛选。
（4）下列材料或用具：
①培养细菌用的培养基与培养皿；②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管；
③实验操作者的双手。
其中需要灭菌的是______
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