细胞工程精华总结.docx
《细胞工程精华总结.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞工程精华总结.docx（44页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
细胞工程精华总结
细胞全能性：
在多细胞生物中每个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，只要条件许可，都可发育成完整的个体。
胚胎干细胞（Embryonicstemcell）是指受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞经分裂培养，即得到胚胎干细胞。
胚胎干细胞具有全能性，可以自我复制（或更新）并具有分化为体内所有组织的能力。
它是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，括生殖细胞。
细胞工程（cellengineering）：
是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。
外植体（explant）：
把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。
细胞系（cellline）:
原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。
如果细胞系不能继续传代或传代次数有限，称为有限细胞系，它由原代培养中的许多细胞系列组成；如细胞系可连续传代，则称为连续细胞系，即已建成的细胞系。
细胞株（cellstrain）：
通过筛选或克隆化，且有特异标记的细胞，这些特性在以后的培养中必须持续存在。
这些特性包括具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。
细胞融合（cellfusion）：
又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。
转基因动物（transgeneticanimal）：
指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。
单克隆抗体：
只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。
核移植技术：
利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。
体外受精（InVitroFertilization，IVF）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术
胚胎移植技术所谓胚胎移植（embryotransfer）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，所以也称为“借腹怀胎”。
胚胎分割技术：
所谓胚胎分割（embryosplitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。
植物转基因技术：
即DNA重组，即将人工分离和修饰的基因导入植物基因组中，由于导入基因的表达而引起植物性状的可遗传的修饰。
转基因技术:
是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术
染色体工程（chromosomeengineering）：
指人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。
主要有人工诱导多倍体，雌、雄核发育，染色体显微操作技术，染色体介导的基因转移技术，人工染色体
胚胎培养：
是指将植物的胚胎与母体分离，培养在人工的培养基上形成幼苗的过程，包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。
胚培养：
采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程
胚珠培养：
是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程
人工种子（artificialseed）是将细胞培养中形成的体细胞胚或不定芽包埋在能提供养分（人工胚乳）的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（人工种皮），造成一种类似于天然种子的结构。
人工种子可在一定条件下萌发生长，形成完整的植株。
1、细胞的全能性（一个细胞所具有的发育成完整生物个体的固有潜能。
）
动：
胚胎干细胞（特性，建系，鉴定）
生物学特性
（1）细胞形态结构及核型：
各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁；?
细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质；?
ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞；④ES细胞增殖迅速，每18—24h分裂增殖1次；⑤可以在体外进行选择、操作、冻存。
冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。
（2）细胞的高度分化潜能：
ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点。
ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。
在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：
“简单类胚体”→“囊状胚体”→细胞分化物。
ES细胞可进行诱导分化。
（3）一般，未分化的ES细胞具有碱性磷酸酶的表达（AKP）
（4）胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达（SSEA－1）
ES细胞的鉴定
（1）细胞的形态结构：
依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。
（2）核型分析：
ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验
（3）碱性磷酸酶（AKP）染色：
常用快绿染色法
（4）SSEA-I免疫荧光标记
（5）分化能力检测：
包括体外分化试验、体内分化试验、嵌合体形成试验、核移植试验
胚胎干细胞的建系
（1）ES细胞的分离:
从着床前（孕3~5d）的胚泡中分离内细胞群（ICM）细胞，是从早期胚胎建立ES细胞系的第一步，也是ES细胞系的最主要的先决条件。
目前ES细胞主要有两个来源，即胚泡内细胞群和生殖嵴中的原始生殖细胞，前者更为常用。
（2）ES细胞的分离培养：
①饲养层的制备及分化抑制物的选择：
常用的饲养层是小鼠成纤维细胞无限系（STO）或小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF）制备而成。
两种细胞可分泌成纤维细胞分化抑制因子LIF，以助ES细胞增殖，抑制细胞的凋亡和分化。
②早期胚胎及PGC的培养和ES细胞的分离传代：
将分离得到的早期胚胎或PGC置于饲养层或条件培养基上，在5%CO2、37~39℃条件下进行培养。
当胚胎内细胞团ICM增殖后或PGC出现ES样克隆后即可用胰酶EDTA消化，用吸管将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层进行传代。
③ES细胞的鉴定；④建档保存。
植：
植物细胞全能性理论是植物细胞的脱分化和再分化
细胞分化（differentiation）：
细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程。
细胞的脱分化（dedifferentiation）:
分化的细胞在一定条件下，可以转变为胚性状态，重新获得分裂能力。
细胞的再分化（rededifferentiation）:
是脱分化后的分生细胞在一定的条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。
影响细胞脱分化、再分化的因素
1.内部因子：
植物遗传性状（基因型）和生理状况：
烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；同一物种不同品种的愈伤组织器官分化的能力也不同（越幼嫩越易再生，茎段高于叶）。
2.外部因子：
营养条件（激素、无机盐、有机营养等），环境条件（pH、渗透压、温度、湿度、光等，春天再生能力高于其他季节）
2、细胞培养技术
动：
体外细胞培养物的生长类型（分型）
体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。
粘附型细胞:
附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。
按照培养细胞粘附生长时的主要形态，主要分两类：
上皮细胞型和成纤维细胞型，其它为不定型（游走型细胞、多形型细胞）。
上皮细胞型：
来源于外胚层，内胚层细胞，类似体内的上皮细胞，呈扁平不规则多角形，中有圆形核。
生长特点：
易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状，生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动
成纤维细胞型：
由中胚层间充质组织起源的组织，似体内成纤维细胞的形态，呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核
生长特点：
排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动。
游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起
悬浮型细胞:
不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
特点：
在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团。
优点：
生存空间大，提供数量大，传代方便（不需消化），易于收获，可获得稳定状态。
缺点：
观察不方便，很多细胞不能悬浮生长（尤以正常细胞）。
体外培养细胞有哪些类型？
其生长特点有什么区别？
答：
体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。
离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。
有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。
（动物细胞培养中，大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生长。
从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞称为单层附壁细胞。
）贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。
按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：
成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；
少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，如白细胞、淋巴细胞及某些肿瘤细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。
由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。
培养细胞的生长特点
（一）贴附：
贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本生长特点。
（细讲以成纤维细胞为例P39）
（二）接触抑制:
一种由细胞接触而抑制细胞运动的现象。
可作为区别正常细胞与癌细胞（无接触抑制）标志之一
（三）密度抑制：
当细胞密度逐步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多，细胞因营养的枯竭和代谢的影响，而分裂停止的现象。
培养细胞的生长和增殖过程
1、单个细胞的生长过程
类似于体内单个细胞生长过程，即细胞周期，指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期，分为G1期、S期、G2期和M期等各个阶段。
G1期：
DNA合成前期。
持续时间长短各种细胞差异较大。
增殖旺盛的持续时间短，衰退的则时间长。
S期：
DNA合成期。
各种细胞持续时间差别较小，比较恒定，平均约6~8h。
此期因DNA在合成过程中核苷酸双链分开，易受到致突变或致癌物的影响，而易造成遗传物质受损。
G2期：
DNA合成后期，又称细胞分裂前期。
持续时间较短，约为2~3h。
对环境敏感，易受温度、pH等影响而停止，但当不利作用因素去除后常能恢复。
M期：
为有丝分裂期，持续时间很短，较稳定，一般1~2h左右，可分为前、中、后、末四期。
细胞处于分裂时称为分裂相，其多少可作为细胞生活状态和增殖情况判断的一个重要参考指标。
2、组织培养细胞生命期（细胞系的生长过程）
所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。
包括原代培养期、传代培养期及衰退期。
原代培养期：
也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。
特点：
细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。
传代期：
当细胞增殖达到一定密度后需要分离出一部分细胞和更新营养液，以继续细胞的生存的过程叫传代。
初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系。
特点：
在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。
衰退期：
此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。
3、每代细胞的生长过程（下面问答题答案）
每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？
各期细胞有何特点？
答：
每代细胞从开始接种到分离再培养，一般要经过以下阶段：
潜伏期、指数（对数）生长期和停止期（平台期）。
①细胞接种培养初期，历经悬浮、贴壁及生长加速的阶段。
细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。
此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。
接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，贴壁出现标志悬浮期结束。
细胞贴附于支持物后，会发生一系列变化，然后还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。
细胞处在潜伏期时，可有生长活动，基本无增殖，少见分裂相。
潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，标志细胞进入指数生长期。
②又称对数期。
此时细胞生长增殖旺盛，细胞成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
细胞分裂相增多。
细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。
）③在细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停止期。
此时细胞数量持平，故也称平台期。
停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，可继续存活一段时间。
该时期细胞形态轮廓增强，最后开始衰退死亡。
植：
植物细胞培养技术就是为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作。
它包括分离、培养、再生以及一系列相关的操作。
就有用化合物的生产来说，它主要是指在无菌条件下通过培养植物细胞生产有用化合物的过程。
植物细胞大规模培养的影响因素
1.外植体的选择
2.环境因子的影响光、温、振荡频率
3.培养基的选择
大规模培养的特点
（1）代谢产物的生产完全在人工控制条件下进行，可以通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超整株植物产量的代谢产物；
（2）培养在无菌条件下进行，可排除病菌和虫害侵扰；（3）可以进行特定的生物转化反应；（4）可以探索新的合成路线和获得新的有用物质等。
植物细胞的大规模培养技术
大规模培养系统：
悬浮细胞培养、固定化培养、植物器官培养
?
固定化植物细胞培养
1.包埋式固定化培养系统：
海藻酸盐、琼脂、卡拉胶、聚丙烯酞胺等
2.附着固定式培养系统：
尼龙网、中空纤维
3、细胞融合技术（cellfusion:
又称体细胞杂交，是指两个或更多歌相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。
）
细胞融合的意义：
通过体细胞杂交获得新的种质资源；解决远缘杂交不亲和的问题；产生新的核外遗传系统；淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。
细胞融合的常用方法：
一、仙台病毒法
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：
①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞
膜上。
并使两细胞相互凝聚；
②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需
要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；
③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
④融合成巨大细胞，仍需ATP。
二、聚乙二醇（PEG）法
机理：
Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
特点：
其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。
步骤：
（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀；
（2）离心沉淀，吸去上清液；
（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；
（4）加9ml培养液，离心沉淀，吸去上清液；
（5）加5ml培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养
液至5ml，37℃的CO2培养箱中培养。
（6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
三、电融合法：
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。
基本过程：
①细胞膜的接触：
当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
②膜的击穿：
原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
动：
简述细胞融合技术的主要方法与技术原理。
答：
促细胞融合的方法有：
病毒融合剂诱发细胞融合，化学融合剂诱发细胞融合，电融合法。
细胞融合的基本技术：
细胞融合实际上包含多个过程：
首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。
融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。
细胞杂交瘤技术与单克隆抗体
单克隆抗体
只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。
因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术（hybridomatechnology）。
简述单克隆抗体的制备过程及主要原理。
针对某一抗原物质A设计一个研究方案，并制备相应的单克隆抗体。
答：
原理：
在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇（即表位），每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。
大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。
基本过程：
先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。
方案：
免疫动物：
将处理好的抗原多次注射到BALB/c小鼠体内，每隔2天注射一次，第3~5天进行试采血检验血清中的抗体，同时可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法采集淋巴细胞（大多为B细胞）细胞富集：
将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异性抗体的B细胞骨髓癌细胞的准备：
用BALB/c小鼠的653。
细胞融合：
用PEG诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合，操作在10min内完成；融合后马上以HAT培养，能活下来的大多为B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的细胞在HAT中因DNA合成抑制而死亡。
未融合的B细胞及B细胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。
使用抗原结合法对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选采用有限稀释法或软琼脂法对杂交瘤细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的克隆；并对单个细胞生长出的群落，再次以ELISA筛选专一性抗体，获得可产生特异性抗体的单克隆细胞株。
用体内法大量制备单克隆抗体：
可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生的腹水，通常每次可取得3～5mL左右。
单克隆抗体的应用
单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性；利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性；单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术；单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。
植：
（细胞融合技术同上，主要比较与动物的不同，如原生质体的分离）
原生质体（protoplast）：
指除去细胞壁的细胞，被质膜所包围的裸露细胞。
植物原生质体融合：
体细胞杂交，将不同来源的植物原生质体（去除细胞壁的细胞）相融合并使之分化再生，形成新物种或新品种技术。
原生质体制备
（1）起始材料叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏。
许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片。
此外,子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织,悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生质体的材料
（2）制备原生质体的材料预处理：
目的是提高原生质体的分裂率。
主要方法：
暗处理、预培养、低温处理。
原生质体分离方法
?
机械分离法：
易破碎、获得率低，为早期分离方法。
?
酶分离法：
纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶,其中纤维素酶和果胶酶是最必要的
植物原生质体的纯化
?
1.过滤法过滤网过滤
?
2.离心法一定渗透压得溶液中，低速离心
?
3.漂浮法高渗溶液
影响原生质体产量与质量因素
1、起始材料及其生理状态：
物种、基因型、外植体
2、酶的种类及活性
3、酶液的渗透压（甘露醇、山梨醇、蔗糖，浓度为0.4－0.6mol/L，将其置于酶液、洗液、培养基中）
4、原生质膜的稳定剂（葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙）
5、pH的影响
6、酶解时间与温度26℃左右
7、分离与纯化方法
外植体生理年龄对原生质体的获得有很大影响
原生质体培养方法
①固体培养法（平板培养法）
纯化后悬浮在液体培养基中的原生质体悬液与热融并冷却至45℃的含琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻摇，混匀，冷却后原生质体被埋在固体培养基中。
②液体培养法
常用液体浅层培养法和悬滴培养法。
液体浅层培养法是将原生质体悬浮液2－3ml于三角瓶或培养皿中培养，初期每天轻摇动2－3次，防原生质体沉积皿底。
③双层培养法（固液结合培养法）
固液结合培养法即双层培养法，在底皿先铺一层固体培养基，其上进行原生质体的液体浅层培养。
植物原生质体再生植株
（1）先愈伤组织，再分化植株
（2）胚状体发生途径
（3）先愈伤组织，后胚状体
植物原生质体的融合
（1）体细胞杂交
植物体细胞杂交即细胞融合是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术。
植物原生质体融合的方法
?
1、盐类融合法
?
2、高钙、高pH融合法
?
3、聚乙二醇（PEG）融合法
?
4、PEG、高钙、高pH相结合融合法
?
5、电融合法
PEG、高钙、高pH相结合融合法的优点是：
一融合成本低，勿需特殊设备；二融合子产生的异核率较高；三融合过程不受物种限制。
电融合的基本过程：
?
1、细胞膜的接触；2、膜的击穿
电融合法三大优点：
一不存在对细胞的毒害问题；二融合效率高；三融合技术操作简便
自体融合单亲本自身原生质体融合同核体
异体融合双亲本原生质体融合异核体
A协和的细胞杂种具有双亲全套染色体组异源二倍体
B部分和谐的细胞杂种少数染色体重组
C异胞质体细胞杂种核是单亲细胞质是双亲（叶绿体和线粒体基因）
D嵌合细胞杂种双亲的细胞核未融合
杂种细胞的筛选（遗传互不选择法，可见标记法）
体细胞杂种的鉴定（杂种植物的形态学鉴定，细胞学鉴定，生化分析鉴定，分子标记鉴定）
4、转基因技术
动：
转基因动物的方法：
反转录病毒法、基因显微注射法、胚胎干细胞移植法
（1）显微注射法：
基本原理——通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内，使使外源基因整合到DNA中，发育成转基因
升级会员 