门冬酰胺酶的制备与分析.docx

门冬酰胺酶的制备与分析.docx

《门冬酰胺酶的制备与分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《门冬酰胺酶的制备与分析.docx（24页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

门冬酰胺酶的制备与分析

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定

赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山

1原理

本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌.L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性,特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL的有很强的抑制作用,目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等,也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等.

目前,我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶,但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低,提取纯化工艺落后.针对这些问题,本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究,意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达,优化其纯化工艺,分析其鉴定方法与性质.

本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择,如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离子交换层析以与亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等.

2实验材料

实验仪器见表1.1.型号和生产厂家根据实验室现有条件核定.

表1.1实验仪器或装置

仪器名称

型号

生产厂家

超净工作台

PCR扩增仪

恒温培养箱

超低温冰箱

台式离心机

恒温摇床

涡轮振荡器

高压灭菌锅

蛋白电泳仪

核酸电泳仪

凝胶成像仪

紫外分光光度计

高效液相色谱仪

扫描型紫外分光光度计

制冰机

超声清洗机

实验试剂和材料见表1.2.材质或规格以与来源根据实验需求以与实验室现有条件核定.

表1.2试剂和材料

试剂或材料

材质或规格

来源

E.coli野生型菌株

CPU21009

实验室储存

pMD18-T

50ng/μl

宝生物工程##

pET-22b

50ng/μl

宝生物工程##

NdeⅠ

10U/μl

宝生物工程##

XhoⅠ

10U/μl

宝生物工程##

T4DNALigase

350U/μl

宝生物工程##

DNA纯化试剂盒

离心柱型

天根生化科技〔〕##

Ni-NTA树脂纯化试剂盒

离心柱型

天根生化科技〔〕##

质粒提取试剂盒

离心柱型

天根生化科技〔〕##

胶回收试剂盒

离心柱型

天根生化科技〔〕##

CaCl2

60mmol/L

实验室储存

PBS

50x

实验室储存

NaCl

分析纯

Taq酶Mix

分析纯

2S2O8

分析纯

C2H6OS

分析纯

CH4O

分析纯

冰乙酸

分析纯

C2H6O

分析纯

氨基丁三醇

分析纯

考马斯亮蓝

分析纯

SDS

分析纯

Nessler's试剂

Reagent,ACS

美国Spectrum公司

酵母粉

分析纯

L-天冬酰胺

分析纯

英国OXOID公司

蛋白胨

分析纯

甘氨酸

分析纯

琼脂糖

分析纯

葡萄糖

食品级

TEMED

优级纯

溴酚蓝

分析纯

IPTG

优级纯

丙三醇

分析纯

3实验思路与步骤

本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA,通过PCR扩增目的基因ansB,随后对PCR产物进行纯化.后分别构建重组克隆载体和表达载体,将克隆载体导入宿主中,筛选阳性克隆,再经双酶切和测序鉴定.后将构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养,利用IPTG诱导表达重组蛋白,对重组蛋白进行提取纯化.再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳测定分子量以与进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较.同时,实验过程中以纳氏试剂法监控L-天冬酰胺酶酶活力,并计算回收率.

3.1大肠杆菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的获取

3.1.1大肠杆菌ansB基因的选择与引物

从NCBI中查找获取大肠杆菌ansB的基因序列,其GeneID为947454,基因长度为1047bp,序列如下：

1atggagtttttcaaaaagacggcacttgccgcactggttatgggttttagtggtgcagca

61ttggcattacccaatatcaccattttagcaaccggcgggaccattgccggtggtggtgac

121tccgcaaccaaatctaactacacagtgggtaaagttggcgtagaaaatctggttaatgcg

181gtgccgcaactaaaagacattgcgaacgttaaaggcgagcaggtagtgaatatcggctcc

241caggacatgaacgataatgtctggctgacactggcgaaaaaaattaacaccgactgcgat

301aagaccgacggcttcgtcattacccacggtaccgacacgatggaagaaactgcttacttc

361ctcgacctgacggtgaaatgcgacaaaccggtggtgatggtcggcgcaatgcgtccgtcc

421acgtctatgagcgcagacggtccattcaacctgtataacgcggtagtgaccgcagctgat

481aaagcctccgccaaccgtggcgtgctggtagtgatgaatgacaccgtgcttgatggccgt

541gacgtcaccaaaaccaacaccaccgacgtagcgaccttcaagtctgttaactacggtcct

601ctgggttacattcacaacggtaagattgactaccagcgtaccccggcacgtaagcatacc

661agcgacacgccattcgatgtctctaagctgaatgaactgccgaaagtcggcattgtttat

721aactacgctaacgcatccgatcttccggctaaagcactggtagatgcgggctatgatggc

781atcgttagcgctggtgtgggtaacggcaacctgtataaatctgtgttcgacacgctggcg

841accgccgcgaaaaccggtactgcagtcgtgcgttcttcccgcgtaccgacgggcgctacc

901actcaggatgccgaagtggatgatgcgaaatacggcttcgtcgcctctggcacgctgaac

961ccgcaaaaagcgcgcgttctgctgcaactggctctgacgcaaaccaaagatccgcagcag

1021atccagcagatcttcaatcagtactaa

根据该基因序列,使用Primer5.0设计引物,并考虑到后续构建克隆载体和表达载体的需求,在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列,获得引物如下：

上游引物P1：

GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA

下游引物P2：

GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG

上游引物P1中包含一个NdeⅠ酶切位点,下游引物中包含一个XhoⅠ酶切位点.所设计引物交由##华大基因科技##负责合成.

大肠杆菌全基因组DNA的提取

使用大肠杆菌基因组DNA全提取试剂盒提取E.coli全基因组DNA,具体步骤如下：

<1>从实验室斜面保存的E.coli野生型菌株CPU21009上,取接种环,挑单菌落,转移到50mL的液体LB培养基,在温度37℃、180r／min发酵过夜.

<2>取菌液1mL至1.5mL的离心管管中,离心机参数调至12000离心2min,离心3min,弃去上清液.

<3>加入0.2mLGA缓冲液,用漩涡振荡器混合沉淀完全悬浮.加入4μLRNaseA<100mg／mL>溶液,用涡旋振荡器振荡振荡15s,室温放置5min.

<4>加入0.02mL蛋白酶K,混合均匀.

<5>加入0.02mLGB缓冲液,混合均匀,将水浴锅调到70℃,把离心管放入10min,短暂离心除去离心管管盖和管壁的水珠.

<6>加入0．22mL分析纯乙醇,在15s内充分混匀,此时会出现絮状物,短暂离心除去EP管盖和管壁的水珠.

<7>将<6>中所得絮状物和液体均加入安装进收集管的吸附柱中,离心机参数调至12000离心1min,弃去柱底液体,安装好吸附柱.

<8>加0.5mLGD缓冲液至吸附柱中,离心机参数调至12000离心1min,倒掉柱底液体,并安装好吸附柱.

<9>加0.6mLPW漂洗液至吸附柱中,离心机参数调至12000离心1min,倒掉柱底液体,并安装好吸附柱.

<10>再加0.5mLGD缓冲液,离心机参数调至12000离心1min倒掉柱底液体.

<11>将吸附柱放入收集管中,离心机参数调至12000离心2min,倒掉柱底液体.在室温下静置20min吸附柱,完全晾干漂洗液,使吸附材料干燥.

<12>将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中,悬滴0.04mL双蒸水到吸附膜的中间部分,在室温静置5min,离心机参数调至12000离心2min,收集溶液.

<13>将<12>中收集的溶液吸净后加回吸附柱,放置5min,离心机参数调至12000离心2min.

<14>将提取后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,以便用于后续操作.

PCR扩增ansB基因

<1>在PCR扩增仪上设计如下反应程序：

①模板DNA预变性94℃5min；

②变性：

94℃条件下45s；

③退火：

58℃条件下30s；

④延伸：

72℃条件下1min；

⑤循环步骤②～④30次；

⑥最后在72℃延伸10min.

<2>在PCR管建立整体为0.05mL的PCR扩增反应体系：

大肠杆菌总DNA模板0.003mL

上游引物P10.001mL

下游引物P20.001mL

Taq酶Mix0.025mL

ddH2O0.02mL

<3>将样品混合后稍作离心,将反应管放入PCR扩增仪中进行PCR反应.

<4>结束PCR扩增,取0.005mL溶液,进行1％Agarosegelelectrophoresis鉴定,判断是否有基因片段存在于PCR中,以与其大小.

3.1.4PCR扩增产物的纯化

<1>将0.04mLPCR扩增后体系用双蒸水调整至0.1mL,加入0.5mL结合液DB,充分混匀.

<2>将<1>中得到的溶液加入安装好的吸附柱,在室温下静置1min,离心机参数调至12000离心1min,倒掉管底的液体.

<3>加入0.5mL用于洗涤的溶液,离心机参数调至12000离心1min,倒掉管底的液体.

<4>加入0.5mL用于洗涤的溶液,离心机参数调至12000离心1min,倒掉管底的液体.

<5>将吸附柱重新安装好,空管离心2min,尽最大可能得除去用于漂洗的液体,防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响.

<6>取吸附柱,悬滴0.04mL双蒸水到吸附膜的中间部分,在室温静置5min,离心机参数调至12000离心2min,收集溶液.

<7>将离心管中的双蒸水,重新加入吸附柱中,室温放置2min后,离心机参数调至12000离心2min.

<8>将PCR纯化产物进行1％Agarosegelelectrophoresis鉴定,以用于后续操作.

3.2重组克隆载体的构建

为了大量准确扩增目的基因片段,采用构建克隆载体的方法.由于PCR扩增时采用的DNA聚合酶为Taq酶,故扩增序列带有一段"A〞,采用TA克隆连接载体.载体选择T载体,且要求载体在宿主细胞内为高拷贝,能够稳定自主表达.这里选用pMD18-T载体.构建好的克隆载体导入宿主中后,要进行阳性克隆筛选与鉴定,并用双酶切回收.

3.2.1目的基因与载体的连接

pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物〔TACloning〕的专用载体.本载体由pUC18载体改建而成,在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点,用EcoRV进行酶切反应后,再在两侧的3＇端添加"T〞而成.因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3＇末端添加一个"A〞的特性,所以可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率.载体酶切图谱如图1.1.

本载体以pUC18载体为基础构建而成,所以它具有同pUC18载体相同的功能.此外,高效连接液SolutionI可以在短时间内〔约30分钟〕完成连接反应,其连接液可以直接用于细菌转化,大大方便了实验操作.实验操作如下：

<1>在一个标准的10μL连接反应体系中加入：

pMD18-T载体1μL

PCR纯化产物1.5μL

ddH2O2.5μL

SolutionI5μL

<2>16℃连接2h.

图1.1克隆载体pMD18-T的酶切图谱

3.2.2大肠杆菌Top10感受态细胞的制备

大肠杆菌TOP10菌株来源于MC1061菌株,是目前实验室最常用的基因工程宿主细胞之一,基因型与DH10B高度类似〔DH10B为galE15型,而TOP10为galU型〕,具有链霉素抗性.其适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传.

<1>从实验室保存的大肠杆菌Topl0菌株斜面上,用接种环挑取单个菌落,转移至液体的50mLLB培养基中,37℃下180r/min摇床过夜发酵.

<2>取0.01mL菌液转移到液体的50mLLB培养基中,37℃下150r/min振荡约3.5h左右,至菌液对数期.

<3>将液体培养基全部移入50mL离心管中并配平,4℃下离心机参数调至3000离心10min,弃去上清液.

<4>添加15mL预冷的氯化钙溶液轻轻吹打.4℃下离心机参数调至3000离心10min,弃去上清液.

<5>添加1.5mL预先冰浴的氯化钙<60mmol/LCaCl2、质量分数为15％的甘油、pH7.2>溶液,用枪轻轻吹至完全悬浮,分装至干净的EP管,每管0.2mL,放在80℃超低温冰箱.

3.2.3重组克隆质粒的转化

<1>含有Ampicillinl00mg/mL的LB培养基的制备.

<2>取一管200μL的大肠杆菌Topl0感受态细胞,在冰上化冻,加入重组质粒的连接产物10μL,轻轻用枪吹打混匀.

<3>另做一个宿主菌阴性对照,即200μL的感受态细胞,加10μL无菌水,混匀.

<4>冰浴30min.

<5>迅速放入在42℃下热击90s,再迅速放回冰中冰浴3min.

<6>加入到1mL的液体LB培养基混合,37℃150r/min培养1h,细胞恢复正常生长,并表达Ampicillin抗性基因.

<7>将上述菌液摇匀后,分别取0.1mL、0.2mL、0.4mL在含有Ampicillin的LB培养基板上均匀涂布.

<8>将上述平板37℃倒置培养过夜<不超过24h>,观察菌斑的出现效果.

3.2.4阳性克隆的筛选与鉴定

<1>从AmpicillinLB培养基板上挑取单个的菌落,液体Ampicillin、LB培养基中振荡过夜,取5mL过夜菌液加入离心管中,离心机参数调至12000离心1min,弃去上清废液.

<2>使用离心柱型质粒提取试剂盒.向菌体沉淀管中加入0.5mLPl溶液<含溶菌酶、核糖核菅酸酶>,用移液设备彻底悬浮细菌细胞沉淀.

<3>向离心管中加入0.6mLP2溶液,翻转6-8次,充分裂解菌体.在这一点上.菌液变得澄清、黏黏的,时间不超过5min,以免损坏质粒.如果不澄清,可能是由于过量加菌液,未能彻底裂解,应减少细菌生长量.

<4>向离心管中加入0.6mLP3溶液,马上轻轻地翻转6-8次,混合彻底,会有白色絮状物出现.离心机参数调至12000离心10min后,离心管底有固体出现.加入P3,立即翻转,避免局部沉淀.若上清液有微小白色固体,再离心取上清.

<5>将上清液加进平衡过的吸附柱中,吸附柱安装好,离心机参数调至12000离心2min,小心地将离心管中的溶液分次加入原有吸附柱,安装好吸附柱.

<6>加入0.6mLPW漂洗液,将台式离心机参数设置为12000,离心1min,倒掉管底废液,安装好吸附柱.

<7>加入0.6mLPW漂洗液,将台式离心机参数设置为12000,离心1min,倒掉管底废液,安装好吸附柱.

<8>将台式离心机参数设置为12000,将组件离心2min,除去吸附柱中的残留的用于漂洗的液体.吸附柱在室温下静置5min,防止用于漂洗的液体中残留的分析纯乙醇在下游反应中有影响.

<9>将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中,悬滴0.04mL双蒸水到吸附膜的中间部分,在室温静置5min,离心机参数调至12000离心2min,收集溶液.

<10>将<9>中收集的溶液吸净后加回吸附柱,放置5min,离心机参数调至12000离心2min.

<11>取5μL质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳.

<12>克隆载体中含有NdeI和XhoI两种限制性酶酶切位点,构建10μL双酶切反应体系：

NdeI

0.5μL

XhoI

0.5μL

10×Hbuffer

1μL

pMDl8-T-ansB质粒

8μL

37℃酶切2h后,取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳.

3.3重组表达质粒的构建

3.3.1重组克隆载体质粒的提取

<1>从相应的培养基上挑取含有重组克隆载体pMDl8-T-ansB质粒

的菌种的单菌落,接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基,用180r/min的参数,在37℃下培养12h以上.在离心管中加5mL收获的菌液,离心机参数调至12000离心lmin,留下沉淀.pMDl8-T-ansB质粒提取过程同的<2>-<11>.

<2>5μL质粒溶液用于琼脂糖凝胶电泳,其余-20℃保存.

3.3.2重组克隆载体和表达载体的分别双酶切反应

<1>NdeI、XhoI双酶切重组克隆载体pMDl8-T-ansB质粒反应体系：

pMDl8-T-ansB质粒

40μL

10×Hbuffer

5μL

XhoI

2.5μL

NdeI

2.5μL

总体积

50μL

<2>pET-22bPlasmid酶切反应体系：

pET-22bPlasmid

40μL

10×Hbuffer

5μL

XhoI

2.5μL

NdeI

2.5μL

总体积

50μL

<3>分别将两个体系置于37℃水浴中酶切2h后,取5μL此进行1％琼脂糖凝胶电泳.

3.3.3酶切片段的胶回收

<1>经琼脂糖凝胶电泳确认酶切结果后,剩下的45μL酶切反应产物中均匀加入5μLl0×上样缓冲液,再全加到大孔胶的上样泳道中.

<2>在100V电压下电泳至条带跑至总胶长的2/3处.将胶块放入EB浓度为0.5μg/mL的溶液中染色,大小为1000bp、5000bp左右.

<3>在紫外灯照射下,判定DNA位置,用干净的刀子分别切下的含有要回收DNA的胶块.

<4>取1.5mLEP管,放到分析天平上称重后,加入切下的胶块再称重,计算胶块的质量.

<5>每100mg胶块加入0.6mLDB溶胶液,按<4>中称取的重量加入相应体积的DB,在55℃下反应10min,使胶块彻底溶于液体.安装好组件,离心机参数调至10000离心1min,收集沉淀.

<6>安装好吸附柱,加0.5mL用于漂洗的液体,离心机参数调至10000离心1min.重复漂洗,去除废液.离心2min,弃去废液.

<7>在室温下静置吸附柱,开启盖,待乙醇气味完全消失后放入干净的EP管,悬滴0.04mL双蒸水到吸附膜的中间部分.在室温静置5min,离心机参数调至12000离心2min,收集溶液.

<8>将<7>中收集的溶液吸净后加回吸附柱,放置5min,离心机参数调至12000离

心2min,EP管中的即为胶回收产物.

<9>胶回收产物5μL进行1％Agarosegelelectrophoresis.

3.3.4构建表达载体pET-22b-ansB

下图所示为表达载体pET-22b的酶切图谱.

图1.2表达载体pET-22b的酶切图谱

pET-22b是一种大肠杆菌表达载体,载体大小在5500bp左右.其含有多克隆位点,其中就含有我们目的基因引物片段构建中引入的NedⅠ和XhoⅠ两种限制性酶切位点.它含有氨苄青霉素抗性标记,且含有PelB信号肽序列,能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔.

<1>取一支1.5mL的干净EP管,按如下加样后混匀：

胶回收双酶切pET-22b质粒产物

18μL

胶回收双酶切ansB片段

6μL

T4DNALigase

3μL

10×Ligasebuffer

3μL

总体积

30μL

<2>用离心机甩一下,使溶液集中于底部.

<3>16℃恒温连接3h后,4℃暂时保存,用于转化BL21感受态细胞.

3.3.5大肠杆菌BL21感受态细胞的制备

从实验室保存的大肠杆菌Topl0菌株斜面上,用接种环挑取单个菌落,转移至50mL液体LB培养基,37℃,180r/min隔夜发酵.感受态细胞的制备步骤同1．3．2．2的<2>-<5>.

3.3.6表达载体pET-22b-ansB的转化

<1>含有Ampicillinl00mg/mL的LB培养基板的制备.

<2>取一管200μL的大肠杆菌BL21感受态细胞,在冰上化冻,加入T4DNA连接产物10μL,轻轻用枪吹打混匀.

<3>另做一个宿主菌阴性对照,即200此的感受态细胞,加10μL无菌水,混匀.

<4>冰浴30min.

<5>迅速放入在42℃下热击90s,再迅速放回冰中冰浴3min.

<6>加入到1mL的液体LB培养基混合,37℃150r/min培养1h,细胞恢复正常生长,并表达Ampicillin抗性基因.

<7>将上述菌液摇匀后,分别取0.1mL在含有Ampicillinl00μg/mL的LB培养基板上均匀涂布.

<8>将上述平板37℃倒置培养过夜<不超过24h>,观察菌斑的出现效果.

3.3.7阳性表达载体pET-22b-ansB的筛选与鉴定

<1>从AmpicillinLB培养基板上挑取单个的菌落,液体Ampicillin、LB培养基中振荡过夜,取5mL过夜菌液加入离心管中,离心机参数调至12000离心1min,弃去上清废液.

<2>向菌体沉淀管中加入0.5mLPl溶液<含溶菌酶、核糖核苷酸酶>,用移液设备彻底悬浮细菌细胞沉淀.

<3>向离心管中加入0.6mLP2溶液,翻转6-8次,充分裂解菌体.在这一点上.菌液变得澄清、黏黏的,时间不超过5min,以免损坏质粒.如果不澄清,可能是由于过量加菌液,未能彻底裂解,应减