SSR技术原理方法及步骤.docx

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SSR技术原理方法及步骤

SSR技术原理-方法及步骤

SSR技术

1.SSR简介

说明：

简单重复序列（SimpleSequenceRepeat，SSR），简单重复序（SSR）也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6bp，其中最常见是双核苷酸重复，即（CA）n和（TG）n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。

SSR标记的基本原理：

根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。

在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。

SSR具有以下一些优点：

（l）一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；

（2）微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；（3）所需DNA量少。

显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA

2）通过核酸数据库查询，从已有序列中搜寻包括SSR的序列并设计引物。

SSR分析实验的主要技术环节：

提取DNA；PCR扩增；电泳及显色；电泳胶板带型的照相、记录；数据分析处理。

其中，PCR产物分离的电泳方法主要有：

高浓度琼脂糖电泳（4%胶只能分辨4-6bp差异）；变性聚丙烯酰胺序列胶电泳；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

　　由于扩增的片段短（一般小于300bp），基因间的差异小（一般为几个bp），故通常使用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在程序上，变性胶虽然比非变性胶麻烦些，但考虑到在非变性胶上会出现人为假象—异源双链分子，比如导致SSR杂合子中出现3-4条带，而不是正常的2条带，从而干扰等位位点统计，因此我们建议在SSR分析中均采用变性胶电泳。

2.ISSR分子标记的实验原理及操作流程

原理：

ISSR（inter-simplesequencerepeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。

其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。

用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。

一、实验材料

　　不同来源的DNA（30-50ng/ul）。

二、实验设备

　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5mleppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。

三、试剂

　　1、ISSR引物：

购买成品或根据加拿大BritishColumbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成

2、Taq酶

3、10xPCR缓冲液

4、MgCl2：

25mmol/L

5、dNTP：

2.5mmol/L。

四、操作步骤：

　　1.在25ul反应体系中，加入

　　　　模板DNA1ul（30-50ng）　　ISSR引物1ul（约5pmol）

　　　　10xPCRBuffer2.5ul　　　　MgCl22ul

　　　　dNTP2ul　　　　Taq酶1单位（U）

　　　　加ddH2O至25ul　　混匀稍离心,加一滴（约20ul）矿物油。

　　2.在PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:

94℃1分钟，45℃-68℃40秒，72℃1-2分钟，共40轮循环。

　　3.循环结束后,72℃10分钟，4℃保存。

　　4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液（6x）于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐，分辨率高）。

　　5.电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。

6.用凝胶成像仪观察、拍照。

操作流程简图：

3.SSRGELandSilverStainingProtocol

PaulaMarquardt&CraigEcht

Publishedin:

EchtCS,May-MarquardtP,HseihM,ZahorchakR.1996.Characterizationofmicrosatellitemarkersineasternwhitepine.Genome39:

1102-1108.

CommentscanbedirectedtoPaulaMarquardtat:

USDAForestServiceResearch

5985HighwayK

Rhinelander,WI54501

USA

Phone:

715-362-1121

Fax:

715-362-1166

e-mail:

pmarquar@

I.EQUIPMENT:

DNAsequencingunit（35x45cm）&2000Vpowersupply

Clamps

Lg.plastictrays（4）,about43x50x8cm,andonelid

Tworockingplatforms

Heatblockformicrotiterplates.Amicroplatevortexerishelpful.

II.MOLDASSEMBLY:

Notes:

Bindsilaneistoxicandshouldbeusedinachemicalfumehood.Weargloveswhenhandlingthissolution.Useasmallpieceofvinyltapeonaloweroutsidecorneroftheacryleasetreatedglassgelplatetomarktheuntreatedsideandalsohelpdistinguishtheplates.Thishelpsavoidconfusionbetweenplateswhenusingoffsetplates.Thetapecanremaininplacethroughseveralelectrophoresis/washingcycles.

1.Washinnerandouterplateswellwithalconoxcleanser.Rinsewellwithtapwater,deionizedordistilledwater,andethanol,airdry.Usededicatedspongesforeachtreatment.

2.Usingakimwipetissue,coattheinnersideofnotchedoroffsetplatewithacrylease（Stratagene）andallowtodry--Idonottreatthetop2inchesoftheplatesinceIfeelthatthenonstickcoatingpromotesleakingbetweenwellsbehindtheteethofthecomb.Buffwellwithakimwipesoakedinethanolforacleanfinish;thistakessomeelbowgreasetogetthestreaksoffoftheplate.Changeglovesbeforeworkingwithbindsilaneandtakecarenottocrosscontaminatetheplateswiththetwotreatments.Theacryleasetreatmentonlyneedstoberepeatedeveryfourgelsorso.

3.Preparefresh1mlbindingsolutionbymakingasolution0.0005-0.001%bindsilane（Sigma#M-6514）in95%ethanol,0.5%glacialaceticacid.Applywithakimwipeandcoattheinnersideofthelargerplatewithonemlandallowtodry4-5minutes.Wipetheplatewithethanolinonedirectionandthenperpendiculartofirstdirection,don"tusetoomuchpressure.Thistreatmentneedstoberepeatedeverytime.

III.GELSOLUTIONPREPARATION:

Note:

Acrylamideistoxic.Weargloveswhenhandlingsolutionandfacemaskwhenweighingoutpowder.Asaferalternativeistobuyapremix.

1.Rinseallglasswareandplasticwarewithd.i.waterpriortogelsolutionpreparationandpouring,includingthedisposablefilterunit.

2.Gelsare6%acrylamide,8Murea,1XTBE.Foreachgel,mixtogether50gurea,15ml40%19:

1acrylamidesolution,and31mld.i.water.Weusea4.5%gelforfingerprintingreactions.

Note:

（Westorealiquotsofpremixed40%Acrylogelsolution,Gallard-SchleisingerInd.,at-20℃.）

3.Warmandstirthemixtureinabeakerofwarmwateruntilalltheureaisdissolved.Add1.25gofamberliteresinandstir5min.Filterthrougha0.2uMfilteranddegasat25mgHgfor5min.Transfertograduatecylinderandadd10ml10xTBE,bringingvolumeto100mlwithd.i.water.

4.WehaverecentlystartedusingBurst-PackfromOwlScientific,whichisanacrylamidepremixincludingthebufferandcatalysts,forourfluorescentgelworkandareverypleasedwiththequalityandreproducibility.Thiswouldbeanoptionforthesilverstainingworkaswell.Theburst-pack"seliminatethechemicalweighingandmixing,deionizing,filteringanddegassingsteps.

IV.GELPOURING:

1.Immediatelypriortopouring,add500ul10%ammoniumpersulfate（0.1g+1mld.i.water）totheacrylamidemixinabeaker,gentlymixingwell.Thenadd50ulTEMEDandmix.PolymerizationwillnotstartuntilTEMEDhasbeenadded.Donotmixthecatalyststogetherbeforeaddingtothepolyacrylamidesolution--thiswillinhibitpolymerization.

2.WeusetheOtteradjustablegelcaster（OWLScientific,Inc.）forpouringgels.Inthissystemthegelispouredhorizontallywiththetopplateslidingoverthebottomplate,withouttheuseoftape,greaseorabottomspacer.

a.Placethelargerplateontocastersothatitabutstheendwallofthecaster.Moistenspacerswithwaterandplacethemflushtotheedgeofglassagainstthecasterwall.

b.Placethetopplate（notchedoroffset）sothatitstopedgeoverlapsthebottomedgeofthelowerplateby3-4cm.Usinga60mlsyringe,slowlydispensethegelsolutionbetweentheplates,allowingthesolutiontoflowbycapillaryaction.Gentlyslidethetopplateacrossthebottomplatewhiledispensingthegelsolutionalongtheleadingedgeofthetopplate.Ifanybubblesformwhilepouring,tryslidingthetopplatebacktouncoverthebubble,thenproceed.Amoreeffectivemethodistodragoutthebubbleswithaplastichook（freebyrequestfromPromegaCorp.）

3.Oncethegelispoured,inserttheflatedgeofasharktoothcomb（oracastingcomb）intothetopofthegeltothedepthdesiredforthewells.Place2-3clampsalongthesidesandtoptokeepplatesintightcontactwiththespacersandcombwhilethegelispolymerizing.

4.Allowthegeltopolymerizeatroomtemperature（RT）for1hour.GelcanbestoredatRTovernightifstepsaretakentopreventitfromdryingout.Todothis,placepapertowelsdampenedwithrunningbufferoverthetop（removeclampsbutleavecombinplace）andbottomedgesofthegelmoldandwrapwithplasticwrap.Donotstorethegelunderbuffer.

V.SAMPLEPREPARATION:

Notes:

Heatsamplesimmediatelypriortoloading.Keeptheloadingdyefresh.UseSSRPloadingdyethatislessthan2weeksold.Thedeionizedformamideusedinmakingtheloadingdyeshouldbelessthanonemonthold.

1.DenaturethesampleDNAbyadding1volume（10ul）offreshSSRPloadingdye（10mMNaOH,95%formamide,0.05%bromophenolblue,0.05%xylenecyanol）to1volumeofPCRsampleinamicrotiterplate.Mixwellandheatto95oCfor2min.Placeonice.2.MolecularweightstandardsarePGEM（Promega）andPoly-dA（Pharmacia#27-7836-01）sonicatedtoproducea1bpladder.PGEMisloadedinawellseparatefrompolyA.WedonotusepolyAforfingerprintinggels.Usinga144-well,microtiter4Xoffsetcomb,load3ulofthemix:

3.4ul1XPerkinElmerIIPCRbuffer

8.6ulof30ng/ulPGEM

12ulofSSRPbuffer

heat95℃for2min.,ice

and

5ul1XPEIIbuffer

2.5ulof400ng/ulofsonicatedPoly-dA

7.5ulSSRPbuffer

VI.ELECTROPHORESIS:

Note:

Addingsodiumacetatetothebottomreservoirduringelectrophoresis（SheenandSeed,1988,Biotechniques6:

942-944）producesthesameeffectasrunningwedgeshapedgelsoraddingagradienttothegelsthemselves（Bigginet.al.,1983,PNAS80:

3963-3965）.Inallthreemethods,themobilityofsmallDNAfragmentsisrestardedastheyapproachthebottomofthegel.Thesodiumacetatemethodissimplerthantheothermethods.

1.Removeclamps.Cleanexcesspolyacrylamideandureafromthetopofplateassemblywithd.i.water.Pullthecomboutofthemoldslowlyandevenly,cleaningoutthecombareawithd.i.waterorbuffer.

2.Addreservoirbufferstotheapparatus.Thetopreservoirbufferis1XTBE.Thebottombufferreservoiris2/3XTBE,1Msodiumacetate.Make1500mlbottombufferforeachgel（100ml10xTBE,900mld.i.water,500ml3MNaAcetate）.

3.Pre-electrophoresefor5-10mintowarmtheplatesothatthecombwilleasilyslideinplace.Cleanoutcombareawithbuffer.Topreventpossiblewelltowellleakage,applyaverylightcoatingofcellosealtotheoutsidesurfaceofthecomb,priortoinsertion.Placeplateassemblyingelboxandclamp.

4.Formicrotiterformat,ahamilton8or12channelsyringeloadingdeviceforloadingthegelsisrecommended.Cleanouteachgroupofwellsimmediatelypriortoloadingwiththemultichannelhamiltonsyringe.Runthegelat50℃constanttemperatureand100wattslimitingpowerforabout1.5-3hours,dependingonsizeofamplificationproduct.ConstanttemperaturecanbemaintainedwiththetemperatureprobeoptionoftheBioRad