植物抗寒性的分子机制.docx

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植物抗寒性的分子机制

植物抗寒性的分子机制

摘要

植物在低温驯化过程中能诱导许多基因的表达，产生的一系列低温诱导蛋白，进而提高植物的抗寒能力。

在冷驯化过程中，质膜首先感受冷信号，调节胞质中IP3的含量，诱导胞质Ca2+浓度的升高，从而激活CBF基因的表达。

不饱和脂肪酸也有助于提高植物的抗寒性。

关键词：

耐寒性低温诱导蛋白CBF转录因子不饱和脂肪酸分子机制

ABSTRACT

Plantcaninduceexpressionofmanygenesduringcoldacclimation,aseriesofproteinsnamedlow-temperature-inducedproteinsareproduced,andthenimprovetheabilityofplant’sfreezingtolerance.Plantcellscansensecoldstressatthecellmembrane,thenincreasecytosolicCa2+andtriggertheexpressionofCBFsduringcoldacclimation.Fattyaciddesaturasescanalsoimprovetheabilityofplant’sfreezingtolerance.

Keywords：

coldtolerancelow-temperature-inducedproteinsCBFtranscriptionalfactorfattyaciddesaturasesmolecularmechanisms

前言

冻害是农业气象灾害的一种，即作物在0℃以下的低温使植物细体内结冰，对膜造成机械性破坏，或导致细胞质脱水，严重影响植物生长发育甚至导致死亡，这在温带地区最常见。

因此，低温是影响植物生长、发育及其地理分布的重要环境限制因素之一。

但是有些植物在低温但非冰冻的环境生长一段时间后，却增强了抗冻能力，从而能耐受细胞外结冰，这个适应过程称为冷驯化（coldacclimation）或低温驯化。

根据植物的种类，达到最大抗冻性的低温驯化时间从数天至数周不等，不同种类植物可以耐受-10℃至-60℃以下的温度。

因此，低温驯化是植物提高抗冻性的有效途径[1，5]。

近二十年来，世界各地的科研工作者围绕在低温驯化过程中植物发生的生理生化和分子水平的各种变化进行了大量的研究，在低温诱导蛋白、低温诱导基因、cDNA文库的构建、DNA序列的测定和同源性分析、体外转录及翻译等方面取得了很多成果，至今已建立了低温诱导的大麦、小麦、水稻、菠菜、苜蓿、拟南芥和甘蓝型油菜等几十种植物的cDNA文库，并从中分离出上百种低温诱导基因。

最新的研究表明，至少有300个低温反应基因参与了低温驯化进程。

植物抗寒性研究已成为植物分子生物学中颇为引人注目的领域之一[1，3]。

一低温诱导蛋白及其功能

低温诱导蛋白（coldinducedprotein），又称冷诱导蛋白，是伴随着植物的低温驯化而出现的新蛋白质。

研究表明，植物的低温诱导蛋白具有十分广泛的生理生化功能[1，8]。

1.1防止细胞冰冻缺水

脱水是冻伤造成的主要伤害之一，所以低温诱导基因编码的部分蛋白与防止细胞冰冻缺水有关。

许多在冷驯化过程中诱导和积累的蛋白质都具有高的Gly含量、高度亲水性以及在达到沸点时仍能保持可溶性这三个特点。

这些特点是与它们的潜在功能相关的。

高含量的Gly可以使蛋白质具有高度柔性和流动性，促使分子内氢键的形成，使蛋白分子具有无规则卷曲构型，保护细胞结构免遭冰冻和严重脱水的伤害。

低温诱导蛋白的高度亲水性一方面参与初生冰晶晶格氢键的形成，以减少细胞内的冰冻伤害，另一方面把足够的水分捕获到细胞内，以阻止冰冻或水胁迫引起的局部缺水。

苜蓿的冷驯化特异蛋白Casls具有大量Gly和Thr，可使其在细胞中保持可溶性，利于提高植物在冰冻时忍受次级脱水胁迫的能力[1，6]。

1.2保护酶在低温下正常行使功能

拟南芥菜在冷驯化过程中存在一种COR15蛋白，在沸点时仍保持可溶性。

体外进行的低温保护证明，COR15蛋白具有高效的低温保护活性，能够非常有效地防止易受低温影响的乳酸脱氢酶因冰冻而失活，它的保护效率比蔗糖高106倍。

拟南芥菜的低温诱导蛋白LT165和LT178，在冷驯化过程中保护重要的酶分子在低温但非冰冻的温度下正常行使功能[1，4]。

1.3低温诱导具有调节功能的蛋白

Castonguay等（1994）发现了第一个富含脯氨酸的低温诱导蛋白——苜蓿的MSACIC蛋白。

除被低温诱导外不被其他条件所诱导。

MSACIC富含Pro（18%）、Ser（13%）、Thr（10%）和Ala（9%），结构上和4种在植物发育过程中起调节作用的蛋白非常相似。

目前正在通过把MSACIC蛋白的反义基因导入苜蓿以研究它在耐冻性形成中的作用[3]。

从苜蓿中纯化得到冷驯化特异蛋白Cas15，含一个重复4次的10肽基序，它富含Gly，具亲水性，属可溶蛋白或外周蛋白，可能是一种定向到核的蛋白，在基因调节或维持核的结构与功能方面起作用[1]。

1.4低温诱导产生对RNA起稳定作用的蛋白质

根据大麦（Hordeumvulgare）低温诱导基因的cDNA克隆Pt59和Pa086的核昔酸序列以及由最长的开放读框导出的氨基酸序列知道，它们所编码的蛋白具有富含精氨酸的碱性结构域。

大麦耐冻能力的强弱和这些精氨酸基序的出现密切相关，富含精氨酸的序列参与了蛋白质和RNA间的相互作用。

推测Pt59和Pa086基因编码的蛋白在冷驯化过程中是以和RNA相互作用的方式起到稳定特定RNA的作用的[1]。

1.5低温诱导热激蛋白

热激蛋白（heatshockprotein，Hsp）是一个蛋白家族，根据其分子量而区分为Hspll0、Hsp90和Hsp70等类群[1]。

在研究植物热激蛋白的早期，人们就已经注意到低温诱导合成的某些蛋白可能与热激诱导产生的蛋白有关。

现代研究证明，低温确实诱导了热激蛋白的产生。

如菠菜、马铃薯、甘蓝型油菜、水稻等植物在冷胁迫时分别可检测到热激蛋白的表达，而且部分热激蛋白还与脱水蛋白存在序列上的相似性，可减轻冷胁迫对膜的损伤，从而增强了组织的耐寒性。

由此可见，虽然热激反应和冷驯化涉及不同的适应性反应，诱导产生自己独特的逆境蛋白，但不同逆境却可以诱导相同的蛋白。

另一方面，推测低温诱导的热激蛋白的功能可能是单独或者和其它HSP构成复合体参与把冷驯化中合成的多肽运输到质膜、核或细胞器中；也可能是作为分子伴侣，具有稳定的功能，帮助冷胁迫造成的变性蛋白进行重新折叠，以恢复其活性[1，10]。

二低温诱导基因的表达调控

2.1植物中的CBF转录因子

近年来，科研人员在模式植物拟南芥中发现的了CBF转录因子及其相应的低温反应途径，使当前抗寒分子生物学与基因工程研究取得了重大突破。

其在抵御骤然降低的低温天气，减少作物因低温胁迫造成的减产等方面具有广阔的应用前景[8]。

2.1.1CBF转录因子的功能

在植物抗寒研究的早期阶段，人们一直致力于低温诱导基因表达的研究以寻找专一的顺式作用元件，发现了CBF转录因子。

CBF转录因子可与其调控的基因上游CRT/DRE元件结合，从而调控该基因的表达。

拟南芥转基因植株中CBF转录激活因子的超表达导致许多生理生化变化，包括编码产生LEA蛋白或亲水多肽，脯氨酸和多种可溶性糖类的合成积累。

CBF转录因子与CRT/DREDNA调控元件特异结合，诱导目的基因的表达，促进这几类物质的合成与积累，从而提高植物的抗逆性。

另外，实验证明，转基因拟南芥中CBF1和CBF2的超表达导致正常温度下COR6.6、COR15a、COR47、COR78等冷诱导基因的表达或增强[1，8]。

2.1.2CBF转录因子作用机制

CBF基因能对低温迅速作出反应，但其表达的机制至今还不清楚。

Gilmour等（1998）曾提出一个CBF调节COR基因表达机理的假说。

他们设想了一个未知的转录激活因子ICE，并认为CBF基因的启动子中存在一个低温调节元件ICEbox，转录激活因子ICE处于不活动的状态，其原因可能是在细胞质中它被一种负调节蛋白所隔离或者是以不能与DNA结合的形式或不能激活转录的形式存在。

当植物处于低温条件下时，信号转导途径被激活，引起转录激活因子ICE或相关蛋白发生变化，从而促使转录激活因子ICE诱导CBF基因的表达，CBF基因能与COR基因启动子中的CRT/DRE元件结合，促进COR基因的表达，提高植物的抗冻性[2，4]。

2.1.3CBF2基因负向调控CBF1、CBF3基因的表达

对拟南芥CBF1、CBF2、CBF3基因在低温调控中作用的研究表明，拟南芥的CBF2基因敲除即形成CBF2基因突变体，在没有面临环境胁迫的条件下，植株中低温诱导基因LTI78、KIN1、COR47和COR15a基因的mRNA含量组成型表达，经过低温处理后，mRNA的含量比对照的含量明显减少。

而在启动子上不含CRT/DRE元件的RCI1A，RCI2A和DREB2A的低温诱导基因的对照植株和低温处理的CBF2基因突变植株的表达水平并不受影响。

而且，在没有环境胁迫的条件下，CBF1和CBF3在CBF2基因突变植株中的表达水平比对照高了许多。

经低温处理，CBF1、CBF3在CBF2基因突变株中表达水平更高。

由此可见，CBF2基因具有负向调控CBF1和CBF3基因表达的作用[8]。

2.2低温胁迫信号的转导

细胞膜上的钙离子通道等信号感受器接受低温胁迫信号后，诱导（保卫）细胞释放Ca2+，或者诱导细胞产生二级信号分子，刺激细胞释放Ca2+，激活蛋白激酶参加蛋白质磷酸化代谢过程，诱导胁迫靶基因表达。

研究表明，作为第二信使的Ca2+参与植物对低温响应过程，并与一些植物低温诱导基因的表达调控相关，如拟南芥的cor6.6／kin1和苜蓿的cas15。

通过改变二级信号分子的生化代谢途径，影响钙离子流释放水平，可以调节低温胁迫基因表达，影响植物的耐冻性。

在冷信号传导过程中，1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）作为重要的信号分子介导细胞内钙库储存的Ca2+释放到胞质，从而调控CBF和COR基因的表达。

拟南芥FRY1基因编码肌醇多聚磷酸盐1－磷酸酶，能降解IP3，对冷信号传递进行负调控。

而Fry1突变体植物的IP3含量比野生型高，COR基因表达增强，其抗冻性也提高[7，11]。

2.3RNA的修饰和核质转运

在冷驯化过程中，基因的诱导和组成性表达的转录都需要加工、运输到细胞质保持一种适合翻译的构型。

RNA可被折叠成二级结构从而影响它的功能。

在冷的胁迫下，植物中一些含有CSP结构域的蛋白上调，也可能是作为RNA伴侣调节翻译。

RZ-1a是拟南芥中的一个锌指结构、甘氨酸含量丰富的RNA结合蛋白，在冷的胁迫下上调。

基因分析证明它在抗冷方面具有作用。

另外一类RNA伴侣，RNA解旋酶，也参与RNA的代谢。

在植物中有一大类DEAD-boxRNA解旋酶。

在拟南芥中其中的一个DEAD-boxRNA解旋酶LOS4在植物的抗冷反应中起重要的作用，参与RNA有效的从核转运到胞质。

拟南芥中的核蛋白AtNUP160（Arabidopsisnucleoporin）控制RNA的运输，在抗冷过程中是至关重要的。

另外，因为los4和atnup160突变体没有生长和发育上的缺陷，在其他非生物胁迫下也没有明显的变化，所以LOS4和AtNUP160蛋白只有在冷的胁迫下才会影响RNA的核质转运[1，8，12]。

三脂肪酸的去饱和作用与植物的抗冻性

植物生理学研究表明，膜的流动性对植物在低温时维持生存起着重要作用，正常情况下呈流动液态镶嵌状态。

对多种植物在低温下生长时体内多不饱和脂肪酸水平的检测发现，冷驯化过程中，普遍伴随着不饱和脂肪酸含量的升高。

而且，植物的冷敏感性与磷脂酰甘油中饱和及反式单不饱和脂肪酸分子形式的总体水平呈正相关。

基于这些研究，曾提出一种至今仍被广为接受的假说，即饱和脂肪酸能使冷敏感植物的膜发生相变，膜中脂双分子层的相变又迅速破坏膜的完整性从而导致植物细胞的受伤或死亡。

因此，抗寒锻炼的一个关键功能是改变物细胞膜的脂肪酸组成[1，6]。

膜脂脂肪酸的不饱和度均增加，可提高细胞结构稳定性，尤其是叶绿体和线粒体膜的稳定性。

水稻、小麦、油菜膜脂的不饱和度与品种的抗寒性成正比。

植物膜质不饱和脂肪酸含量增加，能降低熔点，改变相变温度，增加膜脂的流动性，从而有利于细胞膜的稳定，转化植株的低温伤害显著降低，抗寒性明显提高。

转脂肪酸不饱和酶基因的研究进一步验证了低温冷害的“膜脂相变”学说，也是目前采用基因工程改良植物抗寒冷性的途径之一[6]。

四研究展望

植物的抗寒性为数量性状，受微效多基因控制。

目前已经从植物中分离出的百余种低温诱导基因，只有少数真正具有抗寒作用，因此迫切需要筛选更广泛的种质资源，寻找适合植物利用的抗寒基因。

除此之外，Ca2+信号转导途径是如何协同作用将寒冷胁迫信号传递到细胞核的转录因子，转录因子又是如何调控各种抗寒基因的表达，各种低温诱导蛋白又是如何发挥抗寒活性等问题的分子机制研究是植物抗寒冻基因工程的基础。

植物在感受和转导寒冷信号的过程中，有多种调控基因参与编码产生信号传递因子和调控蛋白质。

目前对植物感受和转导寒冷信号的机制，以及植物抗寒冻的确切分子机制尚不很清楚。

例如，在拟南芥和水稻等植物中，存有不依赖于CBF的信号途径。

植物低温诱导蛋白质的研究虽然已取得很大进展，但迄今对低温诱导蛋白质的研究主要还是通过分析其与已知蛋白质的同源性及一些生理现象确定的，除少数确定为植物适应胁迫过程中的必需蛋白质外，大部分低温诱导蛋白质的功能及其表达机制仍不清楚[2，5]。

随着全序列测定物种的增加以及大量表达序列标签（EST）的产生，精细遗传和物理图谱的构建，反向遗传学、蛋白质组学和比较基因组学在基因功能研究中越来越显示其重要性，人们对冷驯化的分子机制的了解必将越来越清晰[3，9]。

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