永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性.docx

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永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

【摘要】目的:

构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究.方法：

利用SV40T基因和真核表达载体经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能.结果：

经G418700～300mg/L筛选，40d后获得一株阳性克隆.形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征.永生化胚胎肝细胞克隆形成率为%，染色体核型分析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能.结论：

新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.

　　【关键词】永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体

　　【中图号】

　　0引言

　　原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段.但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命.研究显示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择［1-5］.而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择.从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理想而充足的细胞材料.

　　1材料和方法

　　材料含有SV40LargeT抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘广芝教授惠赠，真核表达质粒由本校微生物教研室保存.14～28wk水囊引产死胎由本院妇产科提供，DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；DMSO及秋水仙素为Sigma公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.

　　方法

　　重组质粒的构建及鉴定提取含SV40LargeT的pcD2质粒，限制性内切酶BamHⅠ单酶切，10g/L琼脂糖电泳.回收含目的DNA片段的凝胶，纯化后用T4DNA连接酶与空载体进行连接.制备感受态细胞并提取重组质粒.用限制性内切酶BamHⅠ进行酶切，10g/L琼脂糖电泳鉴定.

　　胚胎肝细胞的分离培养及转染取引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒铺单后打开腹腔，显露游离门静脉后插管，用DHanks液以20mL/min的速度灌入，随后于下腔静脉插管放出积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉.灌注5min至肝脏变色后改为含g/L胶原酶的Hanks液持续灌注5min.取下肝脏，置于含4℃Hanks液的平皿中，剪开肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以100目及200目筛网过滤，500r/min清洗离心３次，每次2min，弃上清，以4℃Hanks液重悬，台盼蓝染色判断细胞活率，肝细胞活率90％时，计数制成肝细胞悬液，以终浓度1×105/mL接种于培养瓶内，选择低糖DMEM培养基，其中含15mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素，培养48h后采用脂质体转染法将重组质粒SV40T/转染至胎肝细胞.用含700mg/LG418的培养液筛选1wk，将G418浓度改为300mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养.

　　细胞形态的观察在倒置显微镜下观察新建肝细胞系的形态，并在电子显微镜下观察细胞的超微结构.

　　细胞生长曲线的测定细胞消化后制成悬液，以103浓度接种于96孔板内，37℃，50mL/LCO2孵箱内培养，每天取8孔加入MTT溶液20μL/孔,37℃继续孵育4h，终止培养吸去上清，加入150μLDMSO，振荡10min，在酶联免疫检测仪上选择490nm波长，测定光吸收值取平均值，连续测定12d.以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线.

　　细胞克隆形成率肝细胞以1个细胞/孔的密度接种于96孔板，连续培养15d，在倒置显微镜下观察含有50个以上细胞的细胞克隆数，按下列公式计算细胞克隆形成率：

克隆形成率＝×100%.

　　软琼脂试验肝细胞预先制成细胞悬液，在60mm培养皿中预先铺上含12g/L琼脂的培养基，将细胞以1×105/皿浓度与37℃预温的含6g/L琼脂的培养基混匀后，接种于平皿内底层琼脂培养基上，连续培养20d后观察克隆形成数.

　　染色体检查取对数生长期的肝细胞加入终浓度为mg/L的秋水仙碱，继续作用4h，收集分裂中期细胞，离心去上清，加入molKCl低渗处理20min，最后经甲醇冰乙酸固定，制片，Giemsa染色后，在油镜下观察染色体形态.

　　免疫组织化学方法检测整合的SV40T基因及ALB在细胞中的表达新建胎肝细胞系常规爬片，PBS清洗，4℃丙酮固定，30mL/LH2O2处理，血清封闭，分别滴加人血清白蛋白单克隆抗体及SV40T单克隆抗体，孵育60min，然后滴加HRP标记的二抗，孵育60min，苏木精复染.脱水、透明、封片、镜检.

　　2结果

　　重组质粒的鉴定重新构建的质粒SV40T/经BamHⅠ单酶切，酶切产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段大小.

　　图1重组质粒酶切鉴定

　　胚胎肝细胞的培养及转染原代胚胎肝细胞经分离纯化，细胞存活率达91%.体外培养48h后，可见80%贴壁，经脂质体转染SV40T/重组质粒，G418筛选40d后出现一簇抗G418的阳性克隆.将其转移至新培养瓶内继续培养.

　　细胞形态观察胚胎肝细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征，传代一次约需5d时间.透射电镜观察，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管重建.

　　图2胚胎肝细胞形态结构

　　细胞生长曲线根据MTT数据绘制的生长曲线显示，细胞在培养第4日进入对数生长期，第7日进入平台期，第12日后开始出现凋亡.

　　图3胚胎肝细胞生长曲线

　　细胞克隆形成率及软琼脂集落形成试验细胞连续培养15d，形成非常明显的克隆，克隆形成率为%.而在软琼脂培养基内，细胞连续生长20d，未见有细胞克隆形成，说明该永生化肝细胞不能在软琼脂培养基内生长.

　　染色体核型分析第16，28，45代肝细胞各计数30个分裂相，均为正常二倍体细胞，染色体为23对，核型结构与正常人肝细胞相同.

　　图4染色体核型分析

　　免疫组织化学检测结果以抗SV40T单克隆抗体作一抗，免疫组化检测可见肝细胞核内的棕色颗粒，证实SV40T基因已整合入胚胎肝细胞.另外该永生化胚胎肝细胞具备合成白蛋白的能力，免疫组化检测可见胞浆内有棕色颗粒着色.

　　图5免疫组织化学染色

　　3讨论

　　近年来在重型肝炎的治疗方面已得到共识，即生物人工肝及肝细胞移植可以作为原位肝移植的有效替代治疗手段治疗肝功能衰竭，而且取得了一定的临床治疗效果.然而由于供肝短缺和原代肝细胞体外培养增殖困难，使得肝细胞材料的相关研究成为关注的热点.人们曾尝试采用异种肝细胞或各种肝细胞系如C3A，HepG2来解决这一问题［6-9］，常用的猪肝细胞应用最为广泛，效果也可靠，但异种肝细胞可引起强烈的免疫排斥反应，而且由此带来的人畜共患疾病的感染无法避免［10］.采用C3A,HepG2的生物人工肝在动物实验及部分临床试验中已取得肯定的结果，可是细胞系的来源为肿瘤细胞，研究显示它的细胞色素P450酶活性、氨清除和尿素合成功能均较差，加之用于处于免疫抑制状态的重型肝炎患者，潜在致瘤的风险始终令人担忧［11-12］.

　　我们利用真核表达载体，将猿猴病毒40大T抗原基因通过脂质体转染至体外培养的原代胚胎肝细胞，经G418筛选40d后获得一阳性细胞克隆.生长曲线观察结果表明，该细胞具有永生化细胞系典型的“S”特征，细胞生长的每一阶段特征明显.光学显微镜下观察，细胞呈典型的上皮细胞样贴壁生长，细胞增殖较快；透射电镜观察发现，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管形成.表明转染肝细胞在形态结构上与原代细胞无明显差异.此外，我们构建的永生化胚胎肝细胞系的克隆形成能力较强，在软琼脂培养基中不能生长，而且核型组成与正常肝细胞相同，说明该细胞没有发生恶性转化.经免疫组织化学检测，转染肝细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入胚胎肝细胞内，另外人血白蛋白在细胞胞浆中有明确表达，说明该细胞系具备分泌蛋白的能力，具有正常肝细胞的某些功能.

　　本研究结果表明，利用SV40T抗原，采用脂质体转染方法建立的这株永生化胚胎肝细胞系，具备了原代肝细胞的典型形态特征以及某些生物学功能，为肝细胞体外长期培养以及功能维持提供了可能，应该可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料，从而为生物人工肝及肝细胞移植临床的广泛应用奠定更加坚实的基础.

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