食品专业生化四个实验.docx
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食品专业生化四个实验
实验一凯氏（Micro—Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量
一、实验目的
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
二、实验原理
常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸等）的含氮量。
含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而有机氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此过程通常称为“消化”。
但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，加快有机物分解，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行，还具有作为消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。
甘氨酸的消化过程可表示如下：
消化：
CH2NH2C00H+3H2S02—2C02+3S02+4H20+NH3
2NH3+H2S04一（NH4）2SO4
蒸馏：
（NH4）2SO4+2NaOH---2H2O+NaSO4+2NH3
吸收：
2NH3+4H3BO3----（NH4）2B4O7+5H20
滴定：
（NH4）2B4O7+2HCl+5H20-----2NH4Cl+4H3BO3
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。
三、器材
1．50mL消化管或1002．凯氏定氮蒸馏装置或改
mL凯氏烧瓶进型凯氏定氮仪
3．50mL容量瓶4．3mL微量滴定管
5．分析天甲6．烘箱
7．电炉8．1000mL蒸馏烧瓶
9．小玻璃珠10．远红外消煮炉
四、试剂
1．消化液（过氧化氢：
浓硫酸：
水=3：
2：
1）200mL
2．粉末硫酸钾一硫酸铜混合物16g
K2SO4与CuS04.5H20以3：
1配比研磨混合。
3．30％氢氧化钠溶液1000mL
4．2％硼酸溶液500mL
5．标准盐酸溶液（约0．01mol／L）600mL
6．混合指示剂（田氏指示剂）50mL
由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0．1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。
这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。
变色范围很窄且灵敏。
7．市售标准面粉和富强粉各2g
五、操作方法
1．凯氏定氮仪的构造和安装
凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应管及冷凝器3部分组成。
蒸汽发生器包括电炉及一个1-2L（升）容积的烧瓶。
蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连，反应管上端有一个玻璃杯，其上端通过反应室外层与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。
反应室外层下端有一开口，上有一皮管夹，由此可放出冷凝水及反应废液。
反应产生的氨可通过反应室上端细管及冷凝器通到吸收瓶中，反应管及冷凝器之间借磨口连接起来，防止漏气。
安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太近，以免放不下吸收瓶。
然后将反应管通过磨口连接与冷凝器相连，根据仪器本身的角度将反应管固定在另一铁支台上。
这一点务须注意，否则容易引起氨的散失及反应室上端弯管折断。
然后将蒸汽发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来。
安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。
2．样品处理
某一固体样品中的含氮量是用lOOg该物质（于重）中所含氮的g数来表示（％）。
因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。
一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。
用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。
每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。
精确称取O1g左右的干燥面粉作为本实验的样品。
3．消化
取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。
各加1颗玻璃珠，在l及2号瓶中各加样品0.1.g，催化剂（K2S04一CuS04·5HO）200mg，消化液5mL。
注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。
在3及4号瓶中各加0.1mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。
每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。
在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。
待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出,S02白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。
消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL（注意慢加，随加随摇）。
冷却后将瓶中溶物倾入50mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。
用水稀释到刻度，混匀备用。
4．蒸馏
（1）蒸馏器的洗涤蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。
关闭皮管夹，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。
约15分钟后，在冷凝器下端放一个盛有5mL2％硼酸溶液和1～2滴指示剂混合液的锥形瓶。
位置倾斜如图所示，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤1～2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。
向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1分钟。
用水冲洗冷凝管口后用手捏紧橡皮管。
此时由于反应室外层蒸汽冷缩，压力减低，反应室内凝结的水可自动吸出进入反应室外层。
最后打开皮管夹，将废水排出。
（2）蒸馏取50mL锥形瓶数个，各加5mL硼酸和1～2滴指示剂，溶液呈紫色，用表面皿覆盖备用。
用吸管取10mL消化液，细心地由蒸馏器小玻杯注入反应室，塞紧棒状玻塞。
将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器F端浸没在液体内。
用量筒取30％的氢氧化钠溶液10mL放人小玻璃杯，轻提棒状玻璃塞使之流人反应室（为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢）。
尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5mL。
再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流人反应室，一半留在玻璃杯中作水封。
加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧皮管夹，开始蒸馏。
此时锥形瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。
自变色时起记时，蒸馏3～5分钟。
移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面。
继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。
蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净。
在小玻璃杯中倒人蒸馏水，待蒸汽很足、反应室外层温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流人反应室，同时立即用另一只手捏紧橡皮管。
则反应室外层内蒸汽冷缩，可将反应室中残液自动吸出，再用蒸馏水自玻璃杯倒入反应室，重复上述操作。
如此冲洗儿次后，将皮管夹打开，将反应室外层中废液排出。
再继续下一个蒸馏操作。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。
（3）滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
六、计算
式中：
C——为标准盐酸溶液摩尔浓度；
V1——滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；
V2——滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；
W——为样品重量（g）。
14——为氮的相对量子质量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，
样品中蛋白质含量（％）=总氮量×6.25
若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氮：
总氮一非蛋白氮
蛋白质含量（g％）=蛋白氮×6.25
七、思考题
1.何为消化？
如何判断消化终点？
2.在实验中加入H2SO4、K2SO4、CuSO4各有什么作用？
3.蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？
4.如何证明蒸馏器洗涤干净？
5.固体样品为什么要烘干？
实验二酪蛋白的制备
一、实验目的
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、实验原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g／L。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH凋至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、器材
1.离心机2.抽滤装置
3.精密pH试纸或酸度计4.电炉
5.烧杯6.温度计
四、试剂与材料
1.牛奶2500mL
2.95％乙醇1200mL
3.无水乙醚1200mL
4.0.2mol／LpH4.7醋酸一醋酸钠缓冲液3000mL
先配制A液与B液。
A液：
0.2mol／L醋酸钠溶液称NaAc.3H2054.44g，定容至2000mL。
B液：
0.2mol／L醋酸溶液称优级纯醋酸（含量大于99.8％）12.0g定容至1000mL。
取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸一醋酸钠缓冲液3000mL。
5.乙醇一乙醚混合液2000mL
乙醇：
乙醚=1：
l（V／V）
五、操作方法
1.将100mL牛奶加热至40℃。
在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4．7的醋酸缓冲液100mL。
用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心15分钟（3000r／min）。
弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2.用水洗沉淀2次，离心10分钟（3000r／min），弃去上清液。
3.在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇一乙醚混合液洗沉淀2次。
最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
4.将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。
5.准确称重，计算含量和得率。
含量：
酪蛋白g／100mL牛乳（g％）
得率：
×100％
式中：
理论含量为3．5g／100mL牛乳。
六、思考题
1.用乙醇、乙醚洗涤沉淀的目的是什么？
2.总结本次实验的关键步骤。
实验三酵母RNA的分离及组分鉴定
一、实验目的
了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
二、实验原理
酵母核酸中RNA含量较多。
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验室最常用的，即将组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA,，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法是用l0％左右氯化钠溶液，90℃提取3~4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
三、器材
1.乳钵2.150mL锥形瓶
3.水浴4.量筒
5.布氏漏斗及抽滤瓶6.吸管
7.滴管8.试管及试管架
9.烧杯10.离心机
11.漏斗
四、试剂和材料
1.0.04mol／L氢氧化钠溶液1000mL
2.酸性乙醇溶液500mL
将0.3mL浓盐酸加入30mL乙醇中。
3.95％乙醇1000mL
4.乙醚500mL
5.1.5mol／L硫酸溶液200mL
6.浓氨水50mL
7.0.1mol／L硝酸银溶液50mL
8.三氯化铁浓盐酸溶液80mL
将2mL10％三氯化铁溶液（用FeCl3·6H20配制）加入到400mL浓盐酸中。
9.苔黑酚乙醇溶液10mL
溶解6g苔黑酚于100mL95％乙醇中（可在冰箱中保存1个月）。
10.定磷试剂50mL
（1）17％硫酸溶液：
将17mL浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83mL水中。
（2）2.5％钼酸铵溶液：
将2.5g钼酸铵溶于100mL水中。
（3）10％抗坏血酸溶液：
10g抗坏血酸溶于100mL水中，贮棕色瓶保存。
溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。
临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。
17％硫酸溶液：
2.5％钼酸铵溶液：
10％抗坏血酸溶液：
水=1：
1：
1：
2（V／V）。
11.酵母粉200g
五、操作方法
将15g酵母悬浮于90mL0.04mol／L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。
将悬浮液转移至200毫升烧杯中。
在沸水浴上加热30分钟后，冷却。
离心（3000r／min）15分钟，将上清液缓缓倾人30mL酸性乙醇溶液中。
注意要一边搅拌一边缓缓倾人。
待核糖核酸沉淀完全后，离心（3000r／min）3分钟。
弃去清液。
用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。
沉淀可在空气中干燥。
取200mg提取的核酸，加入1.5moI／L硫酸溶液10mL．在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。
1.嘌呤碱取水解液1mL加入2mL浓氨水，然后加入约1mL0.1mol／L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。
2.核糖取1支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。
放沸水浴中10分钟。
注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。
3.磷酸取1支试管，加入水解液lmL和定磷试剂1mL。
在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。
六、思考题
1.比较RNA提取的不同方法的原理及区别。
2.本实验RNA组分是什么？
怎样验证的？
实验四 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
一、实验目的
1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及盘状）电泳的操作技术。
3. 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
4. 掌握过氧化物酶的活性的测定。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺 Bis）在加速剂（N,N,N’,N’－四甲基乙二胺简称TEMED）和催化剂（过硫酸胺（NH4）2S2O8简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性
1. 聚合反应
聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMED）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有两种催化体系：
AP-TEMED 属化学聚合作用
核黄素－TEMED属光聚合作用
2. 凝胶孔径的可调性及其相关性质
凝胶性能与总浓度及交联度的关系
凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：
设T（Acr和Bis总浓度）=
·100（％）
c（交联剂百分比）=
·100（％）
式中：
a=Acr克数；b=Bis克数；m=缓冲溶液体积（mL）。
a:
b<10脆硬乳白 a:
b>100糊状易断
凝胶浓度与孔径的关系
T（Acr和Bis总浓度）增加，孔径减小，移动颗粒穿过网孔阻力增加；反之
T（Acr和Bis总浓度）减小，孔径增大，移动颗粒穿过网孔阻力减小；
凝胶浓度与被分离物分子量的关系
分子量增加，阻力增加，移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用
凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
3. 试剂对凝胶聚合的影响
水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理
根据有无浓缩效应可分为：
连续系统：
电泳体系中由于缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：
电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还有浓缩效应。
因而其分离带清晰度及分辨率高。
垂直板电泳：
凝胶是在两块间距几毫米的平行玻璃板中聚合。
圆盘电泳：
凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状。
（三）过氧化物酶染色原理
过氧化物酶催化过氧化氢释放活性氧，进一步氧化联苯胺使之由蓝色变为褐色。
属于活性染色，若酶失活，则不能变色。
（四）过氧化物酶活性的测定原理
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在下过氧化物酶能使愈创木酚氧化生成褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以
A470/min.mg蛋白质（或鲜重g）表示
三、实验器材
1.电泳仪（600V），盘状电泳槽，垂直板电泳槽
2.电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5－7mm，长80－100mm
3.玻璃架
4.微量注射器或微量吸管
5.带长针头的注射器
6.日光灯
7.带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管
四、试剂和材料
1.贮液和工作溶液的配制
贮液及工作溶液的配制
贮液
100mL溶液中的含量
pH
工作溶液混合比
1lmol／L盐酸48.0mL
小孔凝胶（分离胶）
1
Tris36.6g
8.9
l份1号贮液
TEMED0.23mL
2份2号贮液
2
Acr28.0g
l份水
Bis0.753g
4份3号贮液
3
过硫酸铵0.14g
pH8.9，凝胶浓度7％
lmol／L盐酸约48mL
大孔凝胶
Tris5.98g
6.7
（浓缩胶、样品胶）
TEMED0.46mL
1份4号贮液
5
Acr10.0g
2份5号贮液
Bis2.5g
l份6号贮液
6
核黄素4.0mL
4份7号贮液
7
蔗糖40.0g
pH6.7．凝胶浓度2.5％
续表
贮液
100mL溶液中的含量
pH
工作溶液混合比
电极缓冲液
Tris6.0g
甘氨酸28.8g
加水到l000mL
8.3
用时稀释10倍
①贮液放冰箱中一般可保存1-2月，3号贮液只能保存一周。
如有不溶物要过滤。
表中试剂：
Acr一丙烯酰胺；
Bis--甲叉双丙烯酰胺;
TEMED一四甲基乙二胺；
Tris一三羟甲基氨基甲烷。
2.染色液的配制
A液：
称取0.4g联苯胺，加入３mL冰醋酸，溶解后加入17mL蒸馏水 随用随配
B液：
4％NH4Cl C液：
5％ EDTA（pH6.0） D液：
0.3％H2O2
按A：
B：
C：
D：
H2O＝1：
1：
1：
1：
８比例配制
3.测酶活力所需试剂
20mmol/LKH2PO4，30％H2O2，愈创木酚，100mmol/Ll磷酸缓冲液（pH=6.0）
反应混合液：
100mmol/L磷酸缓冲液（pH=6.0）50mL于烧杯中，加入愈创木酚28
L于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。
冷却后加入30％H2O219
L混合均匀保存于冰箱中。
4.酶液的制备
（１）材料：
萌发３－６天的高粱 玉米 小麦种子
（２）步骤：
称取不同植物材料幼苗茎部2g 加入20mmol/LKH2PO420mL于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15min。
倾出上清液，测出总体积,置于冷处。
五 操作方法
1.过氧化物酶活力的测定
取２只光径1cm的比色皿，１只中加入反应混合液３mL、KH2PO4 1mL作为校零对照，另一只加入反应混合液３mL、酶提取液１mL，立即开启，秒表记时，于分光光度计上测量吸光值（λ=470nm）。
每隔一分钟计数一次，连续测定3min。
（吸光值控制在0.1~0.7范围内）
三分钟内吸光值的变化：
（
A470=
）
酶活力（
A470/min.鲜重g）=
式中：
A470---------三分钟内吸光值的变化
V酶-----------酶提取液用量mL
V总------------酶提取液总体积mL
m------------植物材料鲜重g
N--------------酶提取液稀释倍数
2.凝胶的制备
（１）分离胶的制备：
（小孔径凝胶）pH8.9 凝胶浓度7％
将贮液按１号：
２号：
水：
３号＝5mL：
10mL：
5mL：
20mL比例混匀。
用尖头的吸管快速加入玻璃管中（或两层玻璃板之间），高度约3/4。
沿壁加入3－5mm蒸馏水用于隔绝空气，使胶面平整。
静置30－60min完成聚合，用滤纸吸去水分。
（２）浓缩胶制备：
（大孔径凝胶）pH6.7 凝胶浓度2.5％
将贮液按4号：
5号：
6号：
7号＝３mL：
6mL：
3mL：
12mL比例混匀，按上述方法加到分离胶上方距离管上缘0.5cm处（或两层玻璃板之间，距离短玻璃板上缘0.2cm处,放上样品槽模板）。
仔细加入水层，在距管口10cm处用日光灯照射进行光聚合。
照射6－7min凝胶由淡黄变为乳白。
30min完全聚合，在室温下放置30－60min。
取出样品槽模板，用滤纸吸去多余液体。
在电泳槽上下槽中加入稀释10倍的pH8.3电板缓冲液并没过玻璃管顶端（或没过短玻璃板）。
（３）加样
酶提取液：
40％蔗糖＝１：
１，加2滴1％溴蓝指示剂，混匀。
用微量加样器取５0
（或15
）样品混合液，通过缓冲液，小心加到玻璃管中（或样品凹槽底部）。
（４）电泳
接通电源，调节电压，开始为150V，待样品进入分离胶调整至300V。
当指示剂迁移至距下缘１cm时，停止电泳，关闭电源。
（５）染色
取出胶条（胶板），于染色液中染色20min，酶带显蓝色，漂洗后显褐色。
六、思考题
1.简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径？
2.为什么样品会在浓缩胶中压缩成层？
3.为什么要在样中加入少许溴酚蓝和蔗糖？
各有什么作用？
4.根据实验过程的体会总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶电泳，哪些是关键步骤？
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。
它具有电泳和分子筛的双重作用。
1．聚丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺单体和交联剂N1N’一亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。
相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
丙烯酰胺（简称为Acr）：
N,N’一亚甲基双丙烯酰胺（简称为Bis）：
常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）有以下两种：
（1）过硫酸铵TEMED（四甲基乙二胺）系统在Act和Bis的溶液中放人这个催化系统后，过硫酸铵[（NH4）2S208]产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。
聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。
这种
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