植物成分分析.docx

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植物成分分析

一、绪论1

1，植物成分分析的内容:

1、成分:

1）有机化合物（天然产物）2）无机化合物

2、内容:

1）成分提取2）成分分离3）成分鉴定4）成分分析

2，植物化学成分的提取:

1、传统溶剂提取法：

有常温提取和高温提取途径，包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法和连续回流提取法等。

浸渍法（常温提取）：

常温下浸泡植物组织，提取有效成分。

取样—细碎—浸泡—过滤—浓缩

提取液采用极性依次增大的溶剂提取，如二氯甲烷—甲醇—水

渗漉法（常温提取）：

将适度粉碎的植物体置渗漉筒中，由上部不断添加溶剂，溶剂渗过植物体层向下流动过程中浸出提取成分的方法。

渗漉属于动态浸出方法，溶剂利用率高，有效成分浸出完全，可直接收集浸出液。

适用于贵重药材、毒性药材及高浓度制剂；也可用于有效成分含量较低的药材提取。

但对新鲜的及易膨胀的药材、无组织结构的药材不宜选用。

该法常用不同浓度的乙醇或白酒做溶剂，故应防止溶剂的挥发损失。

煎煮法（高温提取）：

系指用水作溶剂，加热煮沸浸提植物成分的一种方法。

适用于有效成分能溶于水，且对湿、热较稳定的成分。

该法浸提成分范围广，往往杂质较多，给精制带来不利，且煎出液易霉败变质。

回流提取法（高温提取）：

用乙醇等易挥发的有机溶剂提取原料成分，将浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提原料，这样周而复始，直至有效成分回流提取完全的方法。

回流法提取液在蒸发锅中受热时间较长，故不使用于受热易破坏的原料成分的浸出。

2、水蒸气蒸馏法：

概念：

系指将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。

该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的浸提。

|分类：

水蒸气蒸馏法可分为共水蒸馏法、通水蒸气蒸馏法、水上蒸馏法。

为提高馏出液的浓度，一般需将馏出液进行重蒸馏或加盐重蒸馏。

常用设备为多能提取罐、挥发油提取罐。

3、超临界流体提取法：

概念：

指利用超临界流体[处于临界温度（Tc）与临界压力（Pc）以上的流体]提取植物有效成分的方法。

常用的有超临界CO2萃取法。

特点（重）：

①提取速度快，效率高

②适于热敏性、易氧化的有效成分的提取，避免了传统方法高温提取且长时间浓缩所致有效成分受热分解、氧化的缺点

③工艺简单，该法适于提取亲脂性、低相对分子质量的物质，而对极性较大、相对分子质量较大的物质提取需加夹带剂，或升高压力，设备投资加大。

应用：

该法适于提取亲脂性、低相对分子质量的物质，而对极性较大、相对分子质量较大的物质提取需加夹带剂，或升高压力，设备投资加大。

4、固相提取法：

概念：

用固定相吸附植物提取液中所需物质或杂质，从而获得较纯提取物的方法。

5、超声波提取法：

概念：

是采用超声波辅助溶剂进行提取的方法。

超声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物的细胞，使溶剂渗透到植物细胞中，较好地提取出化学成分，缩短提取时间，提高提取率。

超声波是频率高于20000赫兹的声波，它方向性好，穿透能力强，易于获得较集中的声能，在水中传播距离远，可用于测距，测速，清洗，焊接，碎石、杀菌消毒等。

6、微波提取法：

概念：

微波辅助提取法（microwave-assistedextraction，MAE）就是利用微波加热的特性来对物料中目标成分进行选择性提取的方法。

特点：

耗能少，耗时短，效率高，不污染环境的“绿色技术”。

通过调节微波的参数，可有效加热目标成分，以利于目标成分的提取与分离。

波长从1mm到1m之间（频率300～30000MHz）的电磁波，介于红外与无线电波之间，而最常用的加热频率是2450MHz。

原理（重）：

植物样品在微波场中吸收大量的能量，细胞内部含水量及其他物质的存在，对微波能吸收较多，而周围的非极性萃取剂则吸收少，从而在细胞内部产生热应力，被萃物料的细胞结构因细胞内部产生的热应力而破裂，使细胞内部的物质直接与相对冷的萃取剂接触，因而加速了目标产物由细胞内部转移到萃取剂中，从而强化了提取过程。

二、绪论2

植物化学成分的分离

|1、经典分离法

|2、离心分离法

3、色谱分离法

1、经典分离法：

溶剂法、分馏法、沉淀法、膜分离法、升华法、结晶法

1）溶剂法（重）：

利用物质的相似相溶特性，用不同溶剂来分离化合物的方法。

极性化合物易溶于极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。

常用溶剂的极性强弱顺序为：

（重）

水-甲醇-乙醇-丙酮-乙酸乙酯-乙醚-氯仿-二氯甲烷-苯-二氯乙烷-四氯化碳-石油醚

2）分馏法：

利用物质具有不同沸点的特性，通过蒸馏来分离化合物的方法。

分常压和减压分馏。

3）沉淀法：

利用物质的溶解性或与某些试剂产生沉淀的性质，对植物成分进行初分离的方法。

几种化合物类的沉淀剂（重）：

生物碱：

雷式胺盐，苦味酸、苦味酮

皂苷：

胆固醇

有机酸：

氯化钙、石灰

多糖和蛋白质：

丙酮、乙醇

4）膜分离法：

利用小分子物质在溶液中可以通过具有一定孔径的膜，而大分子物质不能通过的性质来分离物质。

5）升华法：

用化合物的升华性质来分离化合物的方法。

特点：

效率低，伴有分解现象

6）结晶法：

利用两种或多种可溶性固体化合物在同一种溶剂里溶解度的不同，而加以分离的操作方法。

结晶包括三个过程：

过饱和溶液的形成、晶核的形成、晶体的生长。

|结晶操作顺序（重）：

（1）把要纯化的混合物溶于热的适当溶剂中；

（2）将热溶液趁热过滤，除去不溶性物质；

（3）让滤液缓慢冷却，析出结晶；

（4）滤出晶体、干燥并检验晶体的纯度。

2、离心分离法

1）概念（重）

利用离心机旋转运动产生的离心力，将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，从而达到分离、浓缩目的的方法。

应用于生物大分子，如蛋白质、酶、核糖体等的分离。

2）分类：

差速离心法又称分级离心法，物质颗粒在离心场中因沉降速度不同而采用不同的旋转速度使组分得到分离。

速率区带离心又称沉降速度超速离心，把样品溶液铺于一密度梯度介质液柱的顶部后离心，在一定的离心力作用下粒子在梯度介质中呈分离的区带状沉降,同样的粒子或大分子具有同一沉降速度，处于同一区带，从而达到分离目的

等密度梯度离心法又称沉降平衡超速离心，把样品溶液铺于一等密度梯度介质液柱的顶部或均匀分布于介质中后离心，离心过程中介质形成一个密度梯度，粒子移到与介质相同密度的地方形成区带，从而达到分离目的。

|注意事项（重）

a离心管中的溶液离管口3cm以上。

b离心管在离心套中两两配平，并对称置于离心机中。

c速度从低档缓慢调到高档，并低于离心机最高设定速度。

d有异常响动，应停止离心。

3，色谱法（重）

色谱法（chromatography）：

又称层析法，是一种物理化学分离分析方法。

它是利用混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，使各组分不同程度地分布在固定相和流动相中，从而达到分离的目的。

原理：

吸附原理、分配原理

|系统组成（重）

固定相：

固体、液体（分配色谱）

流动相：

水、有机溶剂、气体

|分类（重）

柱层析：

吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析

薄层层析：

纸层析、玻璃板层析、铝合金板层析

比移值Rf=分离物移动的距离/展开剂移动的距离

|薄层层析过程：

（重）

选板—点样—干燥—展开剂—展开—显色—计算Rf值—鉴定

自制新板，则

选板—涂固定相—干燥—活化—点样—加展开剂—展开—显色—计算Rf值—鉴定

显色法：

蒸汽显色、喷雾显色、浸渍显色、加热显色

开口柱层析法分离物质的过程（重）：

确定固定相—选柱—填充固定相—加入样品—洗脱—TLC法鉴定组分—分批收集—浓缩

三、植物化学成分的鉴定

|1、色谱法

|2、波谱法

|3、色谱-波谱联用

1、色谱法

高效液相色谱法（HPLC）

高效液气色谱法（HPGC）

薄层层析法（TLC）

2、波谱法（重）

核磁共振（NMR）

质谱（MS）

红外光谱（IR）

紫外光谱（UV）

3、色谱-波谱联用技术

液-质联用技术（HPLC-MS）

液-紫联用技术（HPLC-UV）

气-质联用技术（HPGC-MS）

气-红联用技术（HPGC-IR）

|液-质联用技术（LC/HPLC-MS）和气-质联用技术（GC/HPGC-MS）是集植物成分分离、鉴定和定量分析为一体的现代分析技术。

4、植物化学成分的分析

|1、化学分析法

|2、分光光度技术

|3、色谱法

|4、波谱法

|5、色谱-波谱联用技术

极性（重）：

在化学中，极性指一个共价键或一个共价分子中电荷分布的不均匀性。

如果电荷分布得不均匀，则该键或分子为极性，反之，则为非极性。

沉降系数（重）：

物质在单位离心场下的沉降速度，是物质特有的物理常数。

单位为秒。

比移值（重）Rf=分离物移动的距离/展开剂移动的距离

三、色谱学

☐第一节吸附色谱

☐第二节分配色谱

☐第三节分光光度技术

☐第四节高效液相色谱法

☐第五节气相色谱法

☐第六节离子交换层析

☐第七节凝胶层析

☐第八节电泳

吸附色谱

吸附层析（重）：

指用吸附剂作固定相，利用被分析组分对吸附剂表面吸附能力的差异和在流动相中溶解度的差异来进行分析分离的方法。

吸附剂特点（重）:

表面微孔多，吸附性强，分离效果好；活性与含水量有关。

不能重复使用。

吸附剂种类（重）：

硅胶、氧化铝、活性炭和聚酰胺

硅胶（重）：

是最常用的吸附剂，广泛用于酸性和中性物质的分离，如酚类、生物碱、氨基酸、萜类。

一，分配色谱

1）分配层析（partitionchromatography）:

以多孔物质为支持物，吸附一种液膜作为固定相，流动相（与固定相不相溶）中的组分流经固定相时，在两相中发生再分配，因在两相间的分配系数不同，在层析过程中的迁移速度各异，从而实现分离。

分类：

按支持物分：

纸层析硅胶层析

按流动相分：

液-液分配层析气-液分配层析

按支持物填装方式：

常压柱层析高效液相色谱

气相色谱

2）反相层析

反相层析：

固定相极性小于流动相极性的色谱方法，流动相多为水、乙腈、甲醇等强极性溶剂。

特点（重）：

使用方便，寿命较长，溶剂成本低；

柱平衡所需时间较短；

允许样品有较大极性和分子量范围；

可分离离子型化合物。

分离原理（重）：

“双保留原理”，即在反相色谱中，溶质保留行为受到疏溶剂作用和亲硅醇作用的双重影响。

支持物填料（重）：

多以微粒多孔硅胶为基质制备的键合相载体。

常用烷基二甲基氯甲硅烷。

分配系数（重）：

指化合物在固定相与移动相中的浓度之比，通常用来描述化合物在互不相溶的两个相中的分配状况。

柱层析支持物填料（重）：

常用烷基二甲基氯甲硅烷。

ODS硅胶，十八烷基主链（C18H37）硅胶，又称C18gel。

薄层层析（重）：

纸层析

3）纸层析

概念：

以滤纸为支持物，以纸上吸附的水为固定相的分配层析方法。

二、分光光度技术

1）概述（重）：

利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项光谱技术。

主要种类（重）：

可见分光光度法、紫外分光光度法、原子吸收分光光度法和荧光分光光度法

2）仪器组成

光源——波长控制器——样品池——检测器

3）基本原理（重）光吸收定律A=kCLA:

吸光度K：

e摩尔消光系数

4）分析方法标准曲线法、标准比较法、列解联立方程法

三、高效液相色谱法（HPLC）

1）概述（重）：

以柱色谱法为基础，选用具有高效能固定相的耐高压色谱柱，在加压的条件下进行分离，并自动检测分离结果的机器分析技术。

2）特点（重）：

高压、高效、高速、高灵敏度

3）HPLC仪器组成（重）：

高压输液系统、进样系统、色谱柱和检测器

HPLC检测器（重）:

紫外-可见光检测器

荧光检测器

示差折光检测器

光电二级管阵列紫外检测器

☐（重）基线：

流动相通过柱时，检测器响应讯号的记录值。

稳定的基线应该是一条水平直线。

基线峰宽:

色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。

保留时间:

试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间。

它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。

理论塔板数：

组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。

n=16（tR/w）2=5.545（tR/w1/2）2

获取色谱图中信息（重）

1根据色谱峰的个数，判断样品中组份的最少个数；

2根据色谱峰的保留值（或位置），进行定性分析；

3根据色谱峰下的面积或峰高，进行定量分析；

4根据色谱峰的保留值及其峰宽，评价色谱柱分离效能；

5根据色谱峰两峰间的距离，评价固定相（和流动相）选择是否合适

定量分析方法（重）：

外标法：

外标工作曲线法，外标一点法

内标法：

内标工作曲线法，内标一点法

主要差异（重）：

外标法在分析样品中不加标准物质，内标法在分析样品中加标准物质，外标法可分为工作曲线法和外标一点法。

四、气相色谱法（GC）

GC（重点）：

以气体为流动相，以固体吸附剂或涂渍有固定液的固体担体为固定相的柱色谱机器分离技术。

气相色谱法基本理论（重）

塔板理论为代表的热力学理论

速率理论为代表的动力学理论

GC定量分析方法（重）：

归一化法、内标法、外标法。

五、离子交换层析（IEC）（重）

离子交换剂由大分子聚合物基质和带电荷的功能基团两部分组成。

据基质性质分为离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶三种。

离子交换树脂适用于氨基酸、肽、核苷酸、生物碱、萜类等中小分子物质的分离和分析，离子交换纤维素适用于蛋白质、酶等活性大分子。

离子交换凝胶兼有分子筛和离子交换两种功能。

交换容量：

离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物进行交换的能力，它取决于单位质量的交换剂中活性基团的数目。

六、凝胶层析

凝胶层析的原理：

分子筛效应

特点：

设备简单、操作方便、周期短、样品回收率高；分离效果好，重复性高；洗脱调节温和。

应用：

分子的组别分离、分级分离及制备；测定生物大分子的相对分子量；样品脱盐；去除热源物质。

凝胶的骨架是线状的高分子化合物，线与线之间交联连接，形成网状结构。

分类：

葡萄糖凝胶、交联丙烯基葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。

七、电泳（重）

聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：

1、凝胶的孔径可调节，适用范围广，重复性好；

2、化学性能稳定，对温度和PH变化不敏感；

3、机械强度好，弹性大。

无色透明，有利于电泳后进行各种处理；

4、设备简单，所需样品量少，分辨率较高。

电泳技术的应用：

1、分离同工酶；

2、测定蛋白质相对分子质量；

3、测定蛋白质等电点；

4、分离DNA片段。

四、波谱学（重）

红外光谱法的特点：

1）特征性高。

就像人的指纹一样，每一种化合物都有自己的特征红外光谱，所以把红外光谱分析形象的称为物质分子的“指纹”分析。

2）应用范围广。

从气体、液体到固体，从无机化合物到有机化合物，从高分子到低分子都可用红外光谱法进行分析。

3）用样量少，分析速度快，不破坏样品。

红外光谱的特征吸收：

有特征频率区和指纹区。

特征频率区：

频率范围4000-1300cm-1。

几乎所有的有机官能团都在此范围内出现比较固定的特定的红外光谱带。

指纹区：

频率范围1300-500cm-1。

绝大多数由氢原子参与形成的化学键的弯曲振动和无氢原子参与形成的化学键的伸缩振动都在此范围内。

该区吸收峰多而密，不易识别，而且受分子结构的影响较大

化学位移：

在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移现象。

化学位移用“”表示：

小，屏蔽强，共振需要的磁场强度大，在高场出现，反之，在低磁场出现。

核磁共振图谱解析:

（1）峰的数目：

标志分子中磁不等性质子的种类；

（2）峰的强度（面积）：

每类质子的数目；

（3）峰的位移（）：

每类质子在化合物中所处位置；

（4）峰的裂分数：

相邻碳原子上质子数；

（5）偶合常数（J）：

确定化合物构型。

化学结构确定:

化合物C10H12O2，=1+10+1/2（-12）=5

a.δ2.32和δ1.2—CH2CH3相互偶合峰

b.δ7.3芳环上氢，单峰烷基单取代

c.δ5.21—CH2上氢，低场与电负性基团相连

正确：

B

为什么?

质谱分析法：

在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。

质谱：

化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质量m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列而被记录下来的图谱。

核磁共振技术应用:

化合物分子结构的测定,石油化工、医疗诊断。

质谱技术三个分支：

同位素质谱、无机质谱和有机质谱。

有机质谱仪：

包括离子源、质量分析器、检测器和真空系统。

有机化合物在质谱中的分子离子的稳定性（即分子离子峰的强度）有如下顺序：

芳香环＞共轭烯＞烯＞环状化合物＞羰基化合物＞醚＞酯＞胺＞酸＞醇＞高度分支的烃类。

例1某未知物经测定是只含C、H、O的有机化合物，红外光谱显示在3100～3600cm−1之间无吸收，其质谱如图6.9，试推测其结构。

解：

第一步解析分子离子区

（1）分子离子峰较强，说明该样品分子离子结构稳定，可能具有苯环或共轭系统。

分子量为136。

（2）根据M+1/M=9%，可知该样品约含8个C原子，查贝农表（一般专著中都有此表），含C、H、O的只有下列四个式子：

（a）C9H12O（Ω=4）

（b）C8H8O2（Ω=5）

（c）C7H4O3（Ω=6）

（d）C5H12O4（Ω=0）

第二步解析碎片离子区

（1）质荷比105为基峰，提示该离子为苯甲酰基（C6H5CO），质荷比39、51、77等峰为芳香环的特征峰，进一步肯定了苯环的存在。

（2）分子离子峰与基峰的质量差为31，提示脱去的可能是CH2OH或CH3O，其裂解类型可能是简单开裂。

（3）质荷比33.8的亚稳离子峰表明有m/z77m/z51的开裂，56.5的亚稳离子峰表明有

m/z105m/z77的开裂，开裂过程可表示为：

—CO—C2H2

C6H5CO+C6H5+C4H3+

m/z105m/z77m/z51

①电离方式ESI采用离子蒸发方式使样品分子电离，而APCI电离是放电探针促使溶剂和其它反应物电离、碰撞及电荷转移等方式形成了反应气等离子区，样品分子通过等离子区时，发生了质子转移。

②样品流速APCI源允许的流量相对较大，0.2-2mL/min，而ESI源允许流量相对较小，最大只能为1.0mL/min。

③断裂程度APCI源的探头处于高温，可使热不稳定的化合物分解，产生碎片；ESI源探头处于常温，常生成分子离子峰，不易产生碎片。

④灵敏度都很高。

ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性小的化合物。

⑤多电荷APCI源不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析生物大分子。

而ESI源特别适合于蛋白质、多肽类的生物分子，由于它能产生一系列的多电荷离子。

⏹常用的溶剂和缓冲液

a水、乙腈及甲醇LC-MS理想的溶剂

b乙酸和甲酸可降低LC流动相的pH值以提高分离度

c氢氧化铵/氨溶液可提高LC流动相的pH值

d乙酸铵是一种挥发性盐，用于缓冲流动相，并改善色谱分离而不影响MS的性能。

最大浓度不超过0.1mol/L。

⏹不适合的溶剂和缓冲液

a不挥发的盐

b表面活性剂/洗涤剂

c无机酸

⏹其它溶剂和调节剂

a异丙醇、2-甲氧基乙醇及乙醇等

b三氟醋酸（TFA）常用于LC-MS分析肽和蛋白质的化合物

c三乙胺（TEA）

d四氢呋喃（THF）