病原生物学与免疫学实验指导与练习题.docx

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病原生物学与免疫学实验指导与练习题

病原生物学与免疫学

实验指导

（免疫学与微生物学部分）

（适用于护理专业本科生用）

病原生物学与免疫学教研室

免疫学实验指导及练习题

实验一天然免疫功能测定

[实验内容]

中性粒细胞吞噬功能检测

巨噬细胞吞噬功能检测

溶菌酶的测定

[实验要求]

熟悉中性粒细胞吞噬细菌的原理及结果观察。

熟悉巨噬细胞吞噬的原理及其临床意义。

了解溶菌酶的测定。

天然免疫是特异性免疫的基础，并参与和影响特异性免疫，因此检测机体天然免疫功能的状态，是评价机体免疫功能的重要组成部分。

一、中性粒细胞吞噬功能检测

中性粒细胞吞噬细菌的现象称为小吞噬现象，可以通过体外实验观察其吞噬细菌的情况并测定吞噬功能。

【材料】

白色葡萄球菌18小时肉汤培养物、抗凝人血、小试管、玻片、吸管、毛细吸管、瑞氏染色液。

【方法】

1.用酒精棉球消毒耳垂后，取血4滴（约0.2ml），收集于肝素（50u/ml）抗凝管中，混匀。

2.加入白色葡萄球菌18小时肉汤培养物2滴（约0.1ml，12亿菌/ml）。

3.充分混匀，置37℃孵育10分钟后取出。

4.取—滴全血-白色葡萄球菌混合液置于洁净载玻片上，推成薄血片，空气中自然干燥。

5.瑞氏染色瑞氏染液数滴覆盖血膜，染1分钟，再加等量pH6.8PBS与染液混合，染10～15分钟，注意勿使染液干涸。

用蒸馏水冲洗，冲洗时平持玻片，在一端加水，使染料“漂”走。

空气中自然干燥或滤纸印干。

6.油镜观察，可见中性粒细胞吞噬葡萄球菌。

如染色正确，可见细胞核及被吞噬细菌染成紫色，而中性粒细胞的细胞浆则为淡红色。

【结果】

观察100个中性粒细胞，分别记录吞噬细菌的中性粒细胞数和每个中性粒细胞吞入的细菌数。

计算公式为：

二、巨噬细胞吞噬功能检测

巨噬细胞吞噬异物的现象又称为大吞噬现象。

此试验通过检测巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用，了解巨噬细胞的吞噬功能。

【材料】

小白鼠、灭菌肉汤培养基、1%鸡红细胞悬液、Hanks液、肝素、瑞氏染液。

【方法】

1.试验前一天，于小白鼠腹腔内注射灭菌肉汤培养基1ml。

2.试验当天，小白鼠腹腔内注入1%鸡红细胞悬液1ml，轻揉腹部，使鸡红细胞分散。

3.30分钟后，腹腔内注入Hanks液2ml，轻揉腹部，然后吸取腹腔液注入盛有1mlHanks液（内含肝素10单位）试管中，37℃静置30分钟，1500转/分，离心10分钟。

4.取沉淀物作涂片，自然干燥，瑞氏染色，镜检。

【结果】

吞噬率（％）：

指每100个巨噬细胞中吞有鸡红细胞的巨噬细胞数。

吞噬指数：

100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数除以100，即得吞噬指数，即每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。

计算公式同上。

【附录】

1.瑞氏染液配制

称取瑞氏染料0.1克，研磨于60ml甲醇中，过滤，贮褐色瓶中备用。

2.鸡红细胞悬液的制备：

用注射器由鸡心内取血数毫升，加于含枸椽酸钠溶液的试管中，摇匀，离心沉淀，沉淀的红细胞用Hanks液洗涤三次，配成1%浓度即成。

三、溶菌酶的测定

溶菌酶存在于吞噬细胞以及血清、泪液、唾液、痰、鼻腔分泌液等处，能水解G+菌细胞壁的肽聚糖成分，而致细菌崩解。

测定溶菌酶在体液或分泌物中的含量及动态变化，可了解机体的防御功能。

常用的测定方法为平板打孔法，用标准样品制备出标准曲线，便可测定标本中溶菌酶的含量。

【材料】

混有微溶菌（M.Lysodeiktlcus）的1.5%琼脂平板、人的唾液（含有溶菌酶）、打孔器、针头、毛细吸管、量尺。

【方法】

1．2．3．4孔分别加入唾液

5孔加生理盐水

上图：

溶菌酶的测定打孔位置

1.微溶菌菌液的制备菌种于使用前先在琼脂斜面上传代一次，然后再接种在琼脂培养基上，经37℃孵育24小时，用pH6.41/15M的磷酸盐缓冲液，将菌苔洗下，用比浊法使每毫升菌液含相当于2亿个菌。

2.称取1g优质琼脂加入PH6.41/15M磷酸盐缓冲液100ml中，加热溶解。

取1ml菌液加到70℃已溶化之琼脂内，摇匀倾注平板，厚度为4mm。

3.用打孔器（直径6mm）打孔，再用针头挑去琼脂，打孔位置见图。

4.将唾液吐于空平皿中，用毛细滴管吸出滴入孔内（注意不要溢出，不要产生汽泡）。

室温（24～26℃）放置24小时后观察结果。

【结果】

测量溶菌环直径，并作记录。

溶菌环的大小与溶菌酶的含量成正比。

作业：

1.绘图说明小吞噬现象。

思考题：

1.机体内哪些细胞有吞噬作用？

细菌被吞噬后，可能发生几种后果？

2.溶菌酶有何特性？

该试验有何实际意义？

实验二免疫标记技术

[实验内容]

酶联免疫吸附试验——双抗夹心法、间接法、竞争法检测乙肝两对半（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）

[实验要求]

掌握ELISA双抗体夹心法原理，熟悉用此法检测乙肝两对半的操作方法，结果观察。

熟悉乙肝两对半检测结果的临床意义。

了解间接法、竞争法的原理。

免疫标记技术（immunolabellingtechnique）是用荧光素、酶、放射性同位素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测。

是目前应用最为广泛的免疫学检测技术，可定性、定量、定位。

免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性、快速及应用范围广泛等方面远远超过一般免疫血清学方法。

根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术，放射免疫技术，免疫酶技术，免疫电镜技术，免疫胶体金技术、发光免疫测定等。

一、免疫酶技术

免疫酶技术是将抗原-抗体反应的特异性和酶的高效催化反应相结合而建立的新技术。

酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的反应特异性，也不影响酶本身的活性。

可借助酶作用于底物的显色反应，用肉眼或显微镜观察，或用酶标测定仪测定光密度（OD）值等判定结果，酶标测定仪测定光密度（OD）值的灵敏度达ng/ml甚至pg/ml水平。

应用最广的方法是酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA），所用的酶大多为辣根过氧化物酶，其次有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。

每种酶通过与自己的特殊底物反应，产生典型的有色沉淀物。

ELISA技术可分为直接法、间接法、夹心法、标记抗原竞争法等。

ELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg、HBeAg

【原理】

以已知抗体（抗HBs）包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原（HBsAg）结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体（酶标抗HBs），酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。

（上图：

测定抗原的双抗体夹心法原理）

ELISA（双抗原夹心法）—检测HBsAb（原理与双抗体夹心法类似）

ELISA（竞争法）—检测HBeAb、HBcAb

【竞争法原理】

用于检测抗原或抗体。

用已知抗体（抗原）包被，加入待测血清，再加酶标抗原（抗体），加底物显色。

酶标物与待检物竞争与包被物结合。

（上图：

测定抗体的竞争法原理）

【材料】

试剂盒共五盒，分别注明所测抗原或抗体，并以数字代表（1为HBsAg；2为HBsAb、3为HBeAg；4为HBeAb；5为HBcAb）

试剂盒内材料（以测HBsAg为例）

1.包被抗-HBs反应条

1瓶

2.酶结合物

1瓶

3.HBsAg阳性对照

1瓶

4.HBsAg阴性对照

1瓶

5.洗涤液（用前每瓶作1：

20稀释）

1瓶

6.显色剂（TMB）A

1瓶

7.显色剂（TMB）B

1瓶

8.终止液

1瓶

【方法及步骤】

【结果判断】

根据各抗原抗体检测所使用的方法原理，结果显示如下：

1、2、3（即HBsAg、HBsAb、HbeAg）孔显蓝色为阳性“+”，不显色为阴性“-”；4、5（即HBeAb、HbcAb）孔显蓝色为阴性“-”，不显色为阳性“+”。

乙肝两对半检测结果判断如下：

1

HBsAg

2

HBsAb

3

HBeAg

4

HBeAb

5

HBcAb

结果

+

-

-

-

-

携带者

+

-

+

-

+

大三阳

+

-

-

+

+

小三阳

-

+

-

-

-

有免疫力

-

+

-

+

-

感染过正在恢复

【注意事项】

1.试剂盒置2℃～8℃保存，使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。

2.从冷藏环境中取出试剂盒内的全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，需置室温平衡30分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。

3.待测标本不可用NaN3防腐。

4.不同批号试剂请勿通用。

5.结果判断须在10分钟内完成。

6.若浓缩洗涤液出现结晶时，请置37℃至溶解。

作业：

记录并分析乙肝两对半检测结果。

思考题：

1.常见的免疫标记技术有那些？

2.酶联免疫吸附试验的主要类型及原理。

免疫学练习题

（仅供参考）

一、A1型选择题

1.抗原的免疫原性是指:

A.刺激机体免疫系统，产生抗体的性能

B.刺激机体免疫系统，产生致敏淋巴细胞的性能

C.与相应抗体在体内外特异性结合的性能

D.与相应致敏淋巴细胞在体内外特异性结合的性能

E.刺激机体免疫系统，产生抗体和（或）致敏淋巴细胞的性能

2.抗原表面能与相应抗体结合的特殊化学基团称为:

A.表位.B.半抗原 C.共同抗原D.类属抗原 E.异嗜性抗原

3.半抗原:

A.是大分子物质B.通常是蛋白质 C.只有免疫原性

D.只有反应性E.只有与载体结合后才能和相应抗体结合

4.免疫学中的“非己物质”不包括:

A.异种物质B.同种异体物质C.结构发生改变的自身物质

D.胚胎期机体免疫细胞未接触过的自身物质

E.胚胎期机体免疫细胞接触过的自身物质

5.兄弟姐妹间进行器官移植引起排斥反应的物质称为

A.异种抗原B.同种异体抗原C.自身抗原D.异嗜性抗原E.超抗原

6.异嗜性抗原是一种:

 A.共同抗原B.自身抗原C.半抗原D.同种异型抗原E.超抗原

7.抗体与抗原结合的部位是:

A.CH区B.VH区C.CL区

D.VL区E.VH与VL区

8.下列有关抗体的错误描述是:

A.抗体是指具有免疫功能的球蛋白

B.抗体主要存在于血液、体液、黏膜表面及其分泌液中

C.抗体是能和相应抗原特异性结合的球蛋白

D.免疫球蛋白都是抗体E.抗体都是免疫球蛋白

9.能与肥大细胞结合的Ig是:

A.IgAB.IgDC.IgED.IgME.IgG

10.可通过胎盘的Ig是:

A.IgGB.IgMC.IgED.IgDE.IgA

11.新生儿从母乳中获得的Ig是:

A.IgA类抗体B.IgM类抗体C.IgG类抗体

D.IgD类抗体E.IgE类抗体

12.在种系发生过程中最早出现的Ig是：

A.IgA类抗体B.IgM类抗体C.IgG类抗体

D.IgD类抗体E.IgE类抗体

13.下列分泌液中不含IgA的是：

A.唾液B.初乳C.肠道分泌液D.汗液E.支气管黏液

14.补体不具备的生物学功能是:

A.免疫粘附B.溶细胞C.ADCC作用D.炎症反应   E.调理作用

15.经典途径的激活物是：

A.抗原B.抗体C.抗原抗体复合物D.MBL   E.细菌脂多糖

16.补体不具备的作用是：

A.中和毒素作用B.促进中和及溶解病毒C.调理作用D.溶菌作用E.炎症介质作用

17.下面关于细胞因子的叙述哪一项是错误的?

A.细胞因子是由细胞产生的

B.一种细胞只能产生一种细胞因子

C.单一细胞因子可具有多种生物学活性

D.细胞因子可以自分泌和旁分泌两种方式发挥作用

E.细胞因子的作用不是孤立存在的

18.关于MHC-I类分子，下列哪项是正确的？

A.只存在于红细胞上B.只存在于白细胞上C.只存在于淋巴细胞上

D.只存在于巨噬细胞上E.存在于一切有核细胞上

19.下列哪一种疾病与HLA-B27抗原相关性显著:

A.系统性红斑狼疮B.类风湿性关节炎C.重症肌无力

D.强直性脊椎炎E.自身免疫性甲状腺炎

20.下列哪一种细胞不表达HLA-I类抗原:

A.T淋巴细胞B.B淋巴细胞C.成熟的红细胞D.上皮细胞E.中性粒细胞

21.无血缘关系的同种器官移植中,急性排斥反应难以避免的主要原因:

A.HLA系统的高度多态性B.受者的免疫功能常处于紊乱状态

C.移植物血供不良D.受者体内已存在对移植物致敏的淋巴细胞

E.移植物被细菌感染

22.人类B细胞发育成熟的场所是:

A.胸腺B.骨髓C.淋巴结D.脾E.肝

23.具有特异性杀伤作用的细胞是:

A.B细胞B.中性粒细胞C.NK细胞D.CTL细胞E.LAK细胞

24.能够与人类免疫缺陷病毒特异性结合的CD分子是:

A.CD2B.CD4C.CD8D.CD21E.CD28

25.体液免疫的效应包括:

A.中和作用B调理作用C.补体介导的细胞溶解作用

D.抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用E.以上全都是

26.免疫应答过程包括:

A.免疫细胞对抗原分子的识别过程B.免疫细胞的活化过程

C.免疫细胞的分化过程D.免疫效应细胞和效应分子的效应作用

E.以上全部都对

27.在初次免疫应答中产生的抗体主要是:

A.IgGB.IgAC.IgED.IgME.IgD

28.在再次免疫应答中产生的抗体主要是:

A.IgGB.IgAC.IgED.IgME.IgD

29.Tc细胞与靶细胞相互作用

A.受MHC-I类分子限制，不具抗原特异性

B.受MHC-II类分子限制，不具抗原特异性

C.受MHC-I类分子限制，具抗原特异性

D.受MHC-II类分子限制，具抗原特异性

E.受MHC-I类分子限制，不具抗原反应特异性

30.Tc细胞活化的第二信号是由:

A.CD8+分子与MHC-I类分子相互作用产生的

B.CD8+分子与MHC-II类分子相互作用产生的

C.协同刺激分子与相应受体相互作用产生的

D.A和B正确

E.A、B和C正确

31.免疫应答的过程不包括：

A.巨噬细胞对抗原的处理和传递B.T细胞在胸腺内分化成熟

C.T、B细胞的活化、增殖和分化D.效应细胞的效应分子的产生和作用

E.B细胞对抗原的特异性识别

32.新生儿溶血症可能发生于:

A.Rh+母亲首次妊娠，胎儿血型为Rh+

B.Rh+母亲再次妊娠，胎儿血型为Rh+

C.Rh-母亲再次妊娠，胎儿血型为Rh+

D.Rh-母亲再次妊娠，胎儿血型为Rh-

E.Rh-母亲首次妊娠，胎儿血型为Rh-

33.某孕妇为Rh-，第一胎分娩Rh+胎儿，为防止再次妊娠的Rh+胎儿产生溶血，应给Rh-母亲注射:

A.抗Rh因子抗体B.Rh抗原C.免疫抑制剂D.免疫增强剂

E.以上都不是

34.关于I型超敏反应的名称,下述哪项是正确的:

A.超敏反应B.速发型C.细胞毒型D.免疫复合物型E.迟发型

35.关于III型超敏反应反应的名称，下述哪项是正确的:

A.细胞毒型B.免疫复合物型C.抗原抗体复合物型

D.上述的B、CE.迟发型

36.关于IV型超敏反应的名称，下述哪项是正确的

A.免疫复合物型B.迟发型C.速发型D.组织损伤型E.细胞毒型

37.与抗体有关的超敏反应的类型是:

A.I、II型B.II、III型C.I、III型D.I、II、III型E.I、II、III、IV型

38.由T细胞介导的超敏反应的类型是:

A.I型B.II型C.IV型D.III型E.以上都不是

39.在I型超敏反应中,释放组胺等生物活性物质的细胞是:

A.单核细胞B肥大细胞和嗜碱性粒细胞C.中性粒细胞

D.B细胞E.NK细胞

40.在人类速发型超敏反应中起主要作用的免疫球蛋白是:

A.IgAB.IgGC.IgGD.IgEE.IgD

二、名词解释

抗原抗体半抗原细胞因子MHC白细胞分化抗原超敏反应免疫应答

三、简答题

1.简述抗体的功能。

2.简述适应性免疫应答的基本过程。

3.简述超敏反应的种类及Ⅰ型超敏反应的特点。

4.中枢免疫器官的组成及其功能？

5.简述补体的生物学功能。

6.简述抗原的基本特性及影响抗原刺激产生抗体的因素。

7.列举抗原的种类（根据亲缘关系）。

选择题答案：

1-5：

EADEB

6-10:

AEDCA

11-15:

ABDCC

16-20:

ABEDC

21-25:

ABDBE

26-30:

EDACC

31-35:

BCABD

36-40:

BDCBD

微生物学实验指导及练习题

实验一细菌的形态检查

[目的]

1．掌握显微镜油镜的使用和保护。

2．掌握细菌的基本形态和特殊结构。

3．掌握细菌涂片标本的制备及革兰染色的步骤，判断革兰染色性及明确其临床意义。

4．了解特殊结构的染色方法。

5．了解放线菌和霉菌的形态。

6．了解放线菌和霉菌的形态观察方法。

[内容]

一、显微镜油镜的使用方法

（一）普通光学显微镜的接物镜有高倍镜、低倍镜和油镜三种，检查微生物最常用者为油镜，在使用前首先要识别油镜头，在油镜头上常有下列标记：

（1）放大倍数是90×或100×。

（2）油镜头前端有一白圈。

（3）物镜的前面透镜最小。

（4）刻有“油”或外文“HI”（HomogeneImmersions）,“OilImmersion”等字样。

（二）使用方法

（1）使用显微镜时，必须端坐，坐凳和桌面高度配合适宜，显微镜应直立在桌上。

把显微镜的电源线插在适当的电源插座中。

（2）把照明器的开关移到“ON（开）”的位置，滑动光亮控制钮以获得适宜的照明亮度。

集光器越靠近载物台平面，则光线越强；光圈放得越大，光线也越强。

检查染色标本时，光线应强，光圈应放大，集光器要抬高。

检查未染色标本时光线宜较弱，此时应适当缩小光圈，降低集光器。

（3）染色标本上加一小滴香柏油，油勿过多，更勿将油涂开。

（4）置标本于载物台上。

弹簧夹固定，将待检部分移至接物镜下。

（5）转动接物镜旋转盘，使油镜头对准标本。

眼睛从侧面看着，转动粗调节器，使载物台逐渐上升，直至油镜头侵没入油滴内（上升程度是使油镜头几乎与标本接触，但两者切勿相碰！

）然后眼睛转到目镜处，一面观察，一面调节粗调节器使载物台缓慢下降，待获得模糊物象时，再换用细调节器调节至物象清晰为止。

调节时千万不可使用强力将载物台任意上升，以至压碎标本玻片，甚至将贵重的油镜头损坏。

观察标本时，两眼应同时睁开，调节视度圈，使其与瞳距基本一致。

（6）观察完毕，转动粗调节使载物台下降，取下标本片，用滴加有乙酸乙酯的擦镜纸将油镜头的油擦净，再用干净的擦镜纸将镜头擦净

（7）显微镜见图1-1

二、革兰染色法

[原理]

革兰染色的原理可能与下列因素有关：

1．革兰阳性菌等电点（PI2~3）比革兰阴性菌的等电点（PI4~5）低。

在同一PH条件下，革兰阳性菌比革兰阴性菌所带负电荷要多，与带正电荷的碱性染料结合力较牢固，不易脱色。

2．革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，可与进入胞浆内的结晶紫和碘结合成大分子复合物，不易被丙酮酒精或95%乙醇脱色，而革兰阴性菌此种物质量少，吸附染料量也少，形成的复合物分子也较小，故易被丙酮酒精或95%乙醇脱色。

3．革兰阳性菌细胞壁结构较致密,，肽聚糖层很厚，脂质含量少，乙醇不易透入，而且丙酮酒精或95%乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小、通透性降低，阻碍结晶紫和碘的复合物渗出，而革兰阴性菌的细胞壁结构较疏松，肽聚糖层很薄，脂质含量高，易被丙酮酒精或乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫和碘的复合物被乙醇溶解逸出而致脱色。

图1-1显微镜构造

[材料]

1．葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的18~24小时琼脂斜面培养物。

2．载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯等。

3．革兰染色液（结晶紫、碳酸钠、碱性碘液、丙酮酒精、碱性复红），显微镜，香柏油等。

[方法]

（一）细菌涂片标本的制备

取生理盐水→涂片→干燥→固定

1．接种环的使用

接种针和接种环:

由三部分组成,即环（针）、金属柄和绝缘柄三部分（图2-5）。

针（环）部分以白金丝制成为佳，因其硬度适宜，易传热散热，火焰菌后冷却快，不易生锈经久耐用，但因其昂贵，通常用300～500W电热（镍）丝代替。

环直径为2-4mm，长5-8cm。

图2-5接种环和接种针的结构

标准接种环是取斜面上大肠埃希菌菌苔，充满环的空间，在分析天平上称重。

使环内湿重菌量恰为2mg。

标准接种环可用于制备一定浓度的菌悬液或定量接种。

接种针（环）常用酒精灯或煤气灯烧灼灭菌。

接种针用于穿刺接种细菌，接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。

使用时，用右手持接种环的柄部，先将金属丝垂直于酒精灯火焰上，烧红后，继而将连接金属丝的金属棒通过火焰灭菌，待冷后使用，使用前、后均用火焰烧灼灭菌。

2．取生理盐水

取一张洁净载玻片，用接种环取2-3环生理盐水，分别放在洁净的载玻片中不同位置，注意不要距离太近。

3．涂片

左手持细菌培养物底部、右手以持笔式拿着接种环柄，将试管口置于火焰附近，以右手小指对掌夹住试管塞，朝一方向旋松塞子后将塞子取出，再将试管口在酒精灯火焰上烧灼灭菌。

用冷却后的接种环，分别刮取葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌琼脂斜面培养物少许（三种菌在同一张片制备），与生理盐水混合，涂成直径约为1厘米的均匀薄膜涂片，同时灭菌试管口后塞好试管塞，将试管放回试管架。

然后立即将接种环烧灼灭菌，放回原处若用液体材料（如液体培养物，痰、浓汁等），可直接取材涂成薄片。

4．干燥

涂片最好在室温中自然干燥，必要时可将涂片面朝上，小心断续的在弱火高处略烘，以助水分蒸发。

但切勿将细菌薄膜烤焦。

5．固定

目的是杀灭细菌；使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲洗掉；使细菌蛋白质变性易被着色。

方法：

涂片面朝上，于酒精灯火焰上快速来回通过三次，共约2~3秒。

（二）革兰染色方法

1．初染：

在细菌涂片上滴加结晶紫染液和碳酸钠各1~2滴，约30秒后水洗，并将玻片上积水轻轻洒净。

2．媒染：

滴加碱性碘液1~2滴，约30秒后水洗，并将玻片积水洒净。

3．脱色：

滴加丙酮酒精2~3滴，轻轻晃动和斜持玻片，使丙酮酒精流出，如果脱色未完全可再滴加丙酮酒精1~2滴，直至流下丙酮酒精为无色或稍呈淡紫色为止，全程约5-10秒钟，立即水洗，并将玻片上的积水轻轻洒净。

4．复染：

滴加碱性复红1~2滴复染，5秒钟后水洗。

5．镜检：

待标本自然干燥，或用吸水纸吸干，加一滴香柏油于标本上，用油镜观察，注意细菌的形态大小、染色性、排列方式、有无其他特殊结构等。

[结果]

1．染色结果：

葡萄球菌染成